小承氣湯“成分-靶點-通路”的網絡藥理學研究＊

宋曉彤 ，季旭明 ，于華蕓 ，田 升 ，孫美靈 ，趙 月 ，吳智春 ＊＊

（1. 山東中醫藥大學中醫學院 濟南 250355；2. 浙江中醫藥大學基礎醫學院 杭州 310053；3. 山東省中醫經典名方協同創新中心 濟南 250355）

小承氣湯出自《傷寒論》：“陽明病，脈遲……若腹大滿不通者，可與小承氣湯，微和胃氣，勿令至大泄下”，由大黃四兩、厚樸二兩、枳實三枚組成，具有輕下熱結之功效，用于治療陽明腑實證?，F代醫家臨床擴展用于治療手術后腸梗阻[1,2]和胃腸動力恢復[3-5]、便秘[6-8]等胃腸動力障礙性疾病，具有較好臨床療效。中醫經典名方具有整體理論、多組分、多靶點、多途徑的特點，對于復雜疾病的治療提供了廣闊的前景，但本方主要活性成分、靶點仍不清楚，且缺乏整體分析其藥理作用機制的研究。本研究基于網絡藥理學策略，系統研究小承氣湯主要藥效成分、作用靶標、相關通路，闡釋“藥物-靶點-通路”之間的相互作用，以期系統、全面闡釋其物質基礎及作用機制。

1 材料與方法

1.1 小承氣湯化學成分收集及篩選

利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以及中藥綜合 數 據 庫（TCMID，http://119.3.41.228: 8000/tcmid/search/），分別以大黃、厚樸、枳實為關鍵詞，檢索其含有的化學成分。并依據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug-likeness，DL）進行篩選，閾值分別設為：OB ＞ 25%，DL ＞ 0.18。

1.2 化學成分靶點預測及小承氣湯成分-靶點網絡構建

基 于 SwissTargetPrediction 數 據 庫（http://www.swisstargetprediction.ch）以及 STITCH 數據庫（http://stitch.embl.de），將可能性設置為Probability ≥ 0.7，提取上述篩選得到的化學成分的潛在作用靶點；應用Cytoscape3.6.1 軟件構建小承氣湯中藥材-活性成分-靶點網絡圖。

1.3 蛋白互作網絡構建與關鍵靶點篩選

利用 STRING 平臺（https://string-db.org/）將提取的活性成分潛在靶點構建靶蛋白群互作網絡（proteinprotein interaction network，PPI network），應 用Cytoscape3.6.1軟件的“Network Analyzer”功能對PPI網絡進行拓撲結構分析，計算網絡整體的“節點度值分布（Node Degree Distribution）”和“ 介 數 中 心 性（Betweenness Centrality）”兩個重要拓撲參數，以Degree 和 Betweenness 的均數為“卡值”，選取二者同時在卡值之上的靶點為“關鍵靶點”。

1.4 小承氣湯關鍵靶點的基因功能和信號通路分析

利用DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov）對小承氣湯的關鍵靶點進行基因本體論GO（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集，設置P值＜0.01。

1.5 靶點蛋白分子對接

利用 RSCB PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載腫瘤壞死因子α（TNF-α，PDB ID：2AZ5）的3D 結構PDB 格式文件，運用pymol 軟件刪除2AZ5 的水分子及原小分子配體，用AutoDock Tools 1.5.6 添加非極性氫與電荷后保存為pdbqt 格式。利用PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載關鍵化合物的SDF 格式文件，Chem3D 軟件進行能量最小化優化后保存為mol2 格式，AutoDock 處理分子環肽后保存為pdbqt 格式。以TNF-α作為受體，以關鍵活性成分作為配體，運用AutoDock Vina 1.1.2 進行分子對接，設置Grid box 大小為 6 nm × 6 nm × 6 nm，spacing value 0.375，grid centerx= -14.9、y= 70.0、z= 20.9，GA runs=100，population size=150，其他參數設置為默認值。選擇能量最低的構象作為TNF-α與配體的最佳結合構象，保存為 PDB 格式然后用Pymol、DS Visualizer 分析活性成分與TNF-α的結合位點及氨基酸殘基的相互作用力。

2 結果

2.1 小承氣湯化學成分收集與篩選

通過TCMSP 與TCMID 數據庫，結合生物利用度和類藥性進行篩選共收集小承氣湯中3 味中藥共201個化學成分，其中大黃65 個成分，枳實48 個成分，厚樸89個成分，枳實和厚樸2個共有成分。

2.2 化學成分靶點預測及小承氣湯成分-靶點網絡構建

利用SwissTargetPrediction 數據庫及STITCH 數據庫對上述篩選得到的201 個化學成分進行靶點預測，有62 個成分能找到對應潛在靶點248 個，共計得到小承氣湯562 個“成分-靶點”對應信息，其中大黃25 個成分，預測靶點235 個；厚樸13 個成分，預測靶點86個；枳實24個成分，預測靶點241個，提示這62個化學成分為小承氣湯的活性成分。

以大黃、厚樸和枳實三味中藥為中心節點，內圈62 個綠色節點代表62 個化學成分，外圈248 個紫色節點表示潛在靶點，構建小承氣湯“中藥材-活性成分-靶點”網絡圖（圖1），展示了該方多成分、多靶點的作用特征。

2.3 蛋白互作與關鍵靶點分析

將預測的小承氣湯潛在靶點蛋白進行PPI網絡分析，發現PPI 網絡有232 個節點蛋白互作，2519 條相互作用線（圖2）。PPI 網絡平均度值為21.72，平均介數為6.17 × 10-3，網絡度值分布與介數中心性分布整體情況（圖3、圖4）。度值、介數均超過平均值的50 個靶蛋白（表1），處于PPI 網絡中的關鍵位置，可能是小承氣湯實現藥理效應的關鍵靶點。

2.4 小承氣湯關鍵靶點的基因功能分析

通過DAVID 數據庫分析，獲得小承氣湯50 個關鍵靶點的GO 富集分析結果27 條。GO 功能注釋分析顯示，涉及神經元投射、軸突、膜筏等細胞成分（cellular component）條目5 條；涉及染色質結合、類固醇結合、血紅素結合、轉錄激活子活性等分子功能（molecular function）條目6 條；涉及對肌肉伸展的反應、乳腺肺泡的發育、一氧化氮生物合成過程、RNA 聚合酶II 啟動子轉錄的正調控等生物過程（biological process）條目16條（圖5）。

圖1 小承氣湯“中藥材-活性成分-靶點”網絡

2.5 小承氣湯關鍵靶點的信號通路分析

通過DAVID 數據庫分析，獲得關鍵靶點的KEGG通路富集分析結果63 條（圖6）。其中涉及TNF 信號通路、MAPK 信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt 信號通路、炎癥性腸病、色氨酸代謝、VEGF 信號通路等與胃腸道有關的信號通路共8條。

2.6 靶點蛋白分子對接分析

當配體與受體結合越穩定，能量越低，作用就越強，因此選取小承氣湯的5 個核心成分與TNF-α進行分子對接。蘆薈大黃素（aloe-emodin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、兒茶素（(-)-catechin）、木犀草素（luteolin）、厚樸酚（magnolol）與TNF-α的對接結果良好（表2、圖7）。

3 討論

圖2 小承氣湯潛在靶蛋白PPI網絡

圖3 度值分布圖

小承氣湯始見于張仲景《傷寒論》，現今被收錄于國家中醫藥管理局發布的《古代經典名方目錄（第一批）》，由大黃、厚樸、枳實3味中藥組成，重用大黃為君以瀉熱通便，厚樸行氣散滿，枳實破氣消痞，諸藥合用功效在蕩熱攻實，主治傷寒陽明腑實證，臨床應用廣泛。現代研究多涉及成分分析、藥理作用和臨床應用、歷史沿革等[9]，但物質基礎、作用靶點和作用機制不清，本研究以網絡藥理學為切入點，應用TCMSP、TCMID、 SwissTargetPrediciton、 STITCH、 STRING、DAVID 等數據庫，分析小承氣湯的有效活性成分及其作用靶點和作用途徑。

圖4 介數中心性圖

表1 小承氣湯關鍵靶點的拓撲參數

圖5 小承氣湯關鍵靶點GO基因功能分析

陽明腑實證為小承氣湯主證，是指陽明經邪熱不解，由經入腑，或熱自內發，與腸中糟粕互結，堵塞腸道所表現出的，以“痞、滿、燥、實”為特點的臨床證候。研究顯示其本質為胃腸功能失調而導致的全身炎癥反 應 綜 合 征[10]。 應 用 TCMSP、TCMID、STITCH 和SwissTargetPrediction 數據庫篩選出64 個有效活性成分，其中大黃25 個成分主要是蒽醌衍生物；厚樸13 個成分，主要是桉樹腦、厚樸酚、和厚樸酚等酚類成分；枳實24個成分，主要為黃酮類成分，如木犀草素、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黃酮、異橙黃酮等。研究顯示大黃主要成分游離蒽醌衍生物（大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素和大黃酚等）、厚樸核心成分桉樹腦和厚樸酚、枳實成分川陳皮素和黃酮類（木犀草素、甜橙黃酮）等可通過抑制炎性因子釋放、下調NF-κB 通路、抑制誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA 表達、抑制NALP3 炎癥復合體的表達等多條途徑發揮抗炎特性[11-20]；此外大黃的核心成分β-谷甾醇具有類糖皮質激素抗炎作用[21]，大黃成分結合蒽醌衍生物番瀉苷B、掌葉二蒽酮、枳實成分新橙皮苷可調節胃腸運動[22,23]，發揮瀉下作用；尤其是桉樹腦和川陳皮素為胰腺炎、結腸損傷和慢性結腸炎等胃腸疾病的潛在新藥[16,18]。因此，推測小承氣湯的治療作用主要是上述活性成分通過調節炎癥反應和胃腸功能實現的。

基于預測靶點，以STRING 平臺構建PPI，依據拓撲參數篩選出關鍵靶點50 個。表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是位于細胞膜表面的酪氨酸激酶受體，促進中性粒細胞黏附于血管內皮細胞并向炎性部位趨化[24-26]，減少白細胞凋亡，并影響其功能。白細胞趨化的作用與腸黏膜屏障破壞有關，并且白細胞黏附后又會導致結腸組織破壞，造成惡性循環[25]。腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）是炎癥趨化因子和激活因子，過量的TNF-α能夠導致細胞破壞，釋放大量的炎癥介質，增強炎癥局部淋巴細胞浸潤和增殖，加重黏膜炎癥反應[27]。基質金屬蛋白酶 9（Matrix metalloproteinase 9，MMP9）作用于細胞外基質，通過激活P53 抑制細胞生長和促進細胞凋亡從而造成結腸組織損傷[28]。前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2，也稱為COX-2）可催化花生四烯酸通過一系列反應生成前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）[29]。PGE2 是炎癥反應的主要效應分子，可通過調節免疫細胞的分化或增加相關細胞因子的表達起到促炎作用，從而加劇炎癥反應[30]。由此推測，小承氣湯通過影響上述相關蛋白調節炎癥反應，改善胃腸功能。

圖6 KEGG信號通路富集圖

表2 核心成分與TNF-α的結合能

圖7 小承氣湯部分核心成分與TNF-α分子對接圖

研究還發現小承氣湯作用關鍵靶點中存在參與神經遞質轉運、神經遞質代謝、神經遞質受體和神經元遷移相關的MAOA、MAOB、CASP3 和SLC6A4 等，這些基因編碼的蛋白與多種精神性疾病相關[31-33]，可能是小承氣湯治療陽明腑實證之譫語煩熱的作用靶點。

GO 分析顯示，除涉及細胞對白介素1 的反應、細胞對脂多糖的反應、脂多糖介導的信號通路以及一氧化氮生物合成過程的正反饋等炎性介質代謝相關的生物過程，還涉及細胞周期調節、細胞信號轉導等生物過程，提示小承氣湯除了調節炎癥反應、改善胃腸功能外，可能與腫瘤信號、細胞外基質代謝等有一定關系。

KEGG 富集結果顯示，關鍵靶點的KEGG 通路包括與腸道疾病相關的TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、炎癥性腸病、色氨酸代謝、VEGF 信號通路。色氨酸與腸道黏膜的免疫活動密切相關，是評價炎癥性腸病活動度的炎性標志物[34]。炎癥性腸病時可導致色氨酸的消耗以及其代謝產物犬尿氨酸的積累，色氨酸消耗可誘導淋巴細胞生長停滯或抑制其分化，而犬尿氨酸積累則可抑制淋巴細胞分化[35]。在炎癥性腸病中TNF 可誘導上皮細胞凋亡和炎癥反應的發生[36]。MAPK在自身免疫和與炎癥相關的疾病中起著重要作用[37]，MAPKs 需要通過三種細胞外信號調節蛋白激酶（p38，ERK1/2，JNK MAPKs）中的任何一種的磷酸化來激活，隨后信號從細胞表面傳導至細胞核。研究表明，MAPK 可以調節促炎細胞因子（TNF-α和IL-6）的水平并上調促炎細胞的表達[38]。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路是重要的炎癥通路之一，其下游炎癥信號級聯反應加重疾病的發展，TLR2 和TLR4介導的炎癥反應與炎癥性腸病、自身免疫性疾病等多種免疫相關疾病密切相關[39]。缺氧誘導因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）與炎性腸病密切相關，在胃腸道中，HIF-1 調節的基因產物，例如血管內皮生長因子、腸三葉因子、CD73 在腸道炎癥動物模型起到保護作用[40]。血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是內皮細胞的有效激活劑，并且是炎癥性腸病發育過程中誘導血管生成的關鍵因素[41]，結腸內皮細胞中VEGFA 通過上調CAM并誘導中性粒細胞和T細胞的黏附而觸發炎癥。

腸道炎癥以及屏障功能損傷是陽明腑實證的病理基礎[42]，因此推測影響TNF 信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、PI3K-Akt信號通路、炎癥性腸病、色氨酸代謝、VEGF 信號通路是小承氣湯調節腸道屏障功能，治療陽明腑實證的作用途徑。

此外，根據小承氣湯關鍵靶點的KEGG分析，結果還涉及P53 信號通路、膀胱癌通路、大腸癌通路、癌癥中的轉錄失調等癌癥相關通路，但目前并沒有相關文獻報道，這可為經方小承氣湯臨床新用、新藥研發提供一定思路。