銀杏提取物50通過調節(jié)自噬降低ROS水平保護高糖對血管內皮細胞的損傷作用

姚 媛

(四川大學華西第四醫(yī)院，成都 610011)

糖尿病，作為一種以高血糖為特征的慢性代謝紊亂，對人類的生命和健康造成嚴重威脅。今年來糖尿病逐漸發(fā)展成為一個全球性的衛(wèi)生問題，目前亞洲糖尿病的患病總人數(shù)超過2.3億(約占世界糖尿病患病人數(shù)的55%)，預計到2040年，這一數(shù)字將超過3.55億[1]。由于長期存在的高血糖，糖尿病可導致各種組織，尤其是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害等并發(fā)癥[2]。內皮細胞功能障礙是Ⅱ型糖尿病常見的并發(fā)癥之一，患者對胰島素的不敏感化可加速動脈粥樣硬化病變和血管功能障礙，從而增加心血管疾病的發(fā)生風險[3-4]。長期高糖環(huán)境暴露可破壞內皮細胞內代謝平衡，現(xiàn)在的研究顯示，血管內皮細胞損傷與糖尿病微血管病變密切相關。高糖水平下導致眼部血管內皮細胞損傷從而引起視網膜病變，或抑制四肢血管生成，導致傷口愈合緩慢引發(fā)足部潰瘍[5]。

銀杏提取物50(Ginkgo Biloba Extract 50，GBE50)是一種新型銀杏葉提取物， 現(xiàn)在研究分析發(fā)現(xiàn)GBE50含有44.1%銀杏黃酮糖苷和6.4%的銀杏內酯，且銀杏酸含量低于5 ppm[6]。一些研究表明，GBE50具有抗氧化和抗炎作用，并已用于老年人群心血管疾病的預防或治療[7]。有文獻報道，GBE50可通過抑制人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)ROS生成起到抗凋亡作用[8]，然而在高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs的作用未見報道[9]。

本研究主要通過高葡萄糖(glucose)濃度建立細胞高糖環(huán)境，通過MTT法研究了GBE50對HUVECs細胞活性的影響，通過熒光反應法研究了谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl +glycine,GSH)的含量變化，通過流式細胞實驗研究了HUVECs中活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量和GBE50對細胞自噬的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人臍靜脈內皮細胞系HUVECs購自美國ATCC(ATCC-CRL-1730TM)公司。

1.2 主要試劑與儀器

GBE50購自中國山西千匯藥業(yè)有限公司(0004320181202)。免疫熒光中鼠兔抗Anti-LC3等抗體均購買自美國Abcam公司。細胞培養(yǎng)實驗中胎牛血清(FBS)以及DEME培養(yǎng)基購買自美國Hyclone，青霉素和鏈霉素購買自美國Invitrogen。MTT和實驗中其它試劑均購自美國Sigma。細胞培養(yǎng)箱購買自美國Thermo(3111)，酶標儀購自美國Bio-Rad，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus(IX51)，流式細胞儀購自美國BD(FACSAria III)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與處理

HUVECs細胞培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。 DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清，100 U/mL青霉素或100 μg/mL鏈霉素。取對數(shù)期細胞轉移至96孔板，在培養(yǎng)基中營造正常(5×10-3mol/L葡萄糖)和高糖環(huán)境(3×10-2mol/L葡萄糖)。GBE50以二甲基亞砜溶解后添加至培養(yǎng)基(9×10-2mol/L)，培養(yǎng)72 h后進行相關細胞實驗。

1.3.2 MTT

用MTT法檢測細胞活性。取對數(shù)期細胞接種于96孔板，培養(yǎng)基中加入5×10-2mol/L培養(yǎng)24 h，加入MTT溶液室溫孵育4 h，隨后加入DMSO溶解結晶。10 min后測量570 nm 處OD值。

1.3.3 GSH檢測

為了檢測谷胱甘肽的活性，通過特異性染料CMAC標記谷胱甘肽。取對數(shù)生長期細胞，以1×103密度接種在6孔板。培養(yǎng)一段時間后棄去培養(yǎng)基加入藍色CMAC染料 (1∶1000)，在37℃下孵育20 min，PBS沖洗兩次。檢測353～446 nm處的熒光強度。

1.3.4 免疫熒光

取對數(shù)生長期細胞接種于8孔板。GBE50處理72 h后，甲醇固定10 min，1% BSA封閉，0.1% TRIton X-100洗滌，與兔抗LC3一抗(1∶200)室溫下孵育1 h。PBS洗滌后熒光顯微鏡下觀察，CellSense軟件分析。

1.3.5 MDC檢測

MDC是成熟自噬空泡的特異性標記物。為了觀察MDC標記的自噬空泡，將HUVECs與MDC溶液(5×10-5mol/L)在37℃下孵育。24 h收集細胞，用PBS洗滌2次，固定于4%多聚甲醛中。通過CellSense Software Ver.1.4采集熒光圖像。熒光強度通過流式細胞儀FACSCalibu測定，使用FlowJo軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

1.3.6 ROS檢測

熒光探針DCFH-DA可在細胞內被氧化為高熒光化合物DCF，隨后進行流式分選測定ROS陽性細胞數(shù)目。細胞與10 μmol/L DCFH-DA在37℃下洗滌30 min，再用冰涼PBS洗滌兩次.用活細胞成像系統(tǒng)(奧林巴斯LCS系統(tǒng)，日本)對細胞熒光強度進行量化。采用流式細胞儀測定GBE50處理后細胞內 ROS含量。取對數(shù)生長期細胞，在48孔板中培養(yǎng)72 h。在室溫下，加入10 μmol/L DCFDA孵育30 min，用PBS洗滌3次。FACSCalibur流式細胞系統(tǒng)測量熒光強度，F(xiàn)lowjo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3.7 蛋白質免疫印跡

收集細胞經勻漿后，經RIPA(碧云天，上海)裂解提取蛋白。通過BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，上海)測定蛋白濃度。蛋白經SDS-PAGE電泳后，將蛋白電轉至PVDF膜，PVDF膜經封閉后，室溫分別孵育一抗(1∶1000稀釋的LC3抗體，Cell Signaling Technology，美國)1.5 h，TBST洗膜3次后，室溫孵育1∶2000稀釋的二抗(HRP標記的IgG， Cell Signaling Technology，美國)45 min，TBST洗膜3次后，利用增強的ECL化學發(fā)光試劑盒(#P0018AS，碧云天，上海)對目的條帶顯影，以β-actin(#AF0003，碧云天，上海)為內參，采用AlphaView軟件測量目的條帶的光密度。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 高糖環(huán)境下GBE50增強HUVECs細胞活性

首先，本研究通過MTT實驗研究了GBE50對高葡萄糖環(huán)境下HUVECs細胞活性的影響。實驗結果顯示，相比于正常培養(yǎng)環(huán)境組細胞，高糖環(huán)境下(3×10-2mol/L)HUVECs細胞活性顯著降低(圖1，P<0.001)，而GBE50處理后可顯著升高HUVECs細胞活性(P<0.01)。并且我們還發(fā)現(xiàn)，在低糖環(huán)境下(5×10-3mol/L)GBE50對HUVECs細胞活性并沒有影響。

注：GBE50可緩解高糖環(huán)境引起的細胞活性降低。與Glu5 mmol/L BE50-相比，###P <0.001；與Glu30 mmol/L GBE50-相比，**P <0.01。圖1 高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs細胞活性的影響Note. GBE50 alleviated high glucose-induced cell viability decreasing.###P <0.001vs Glu5mmol/LGBE50-,**P <0.01 vs Glu30mmol/LGBE50-.Figure 1 Effect of GBE50 on cell viability of HUVECs in a high glucose environment

2.2 高糖環(huán)境下GBE50降低HUVECs中ROS生成

隨后本研究通過流式細胞實驗研究了HUVECs內ROS產物的變化情況。DCF染色后流式細胞分析結果顯示，高糖處理可顯著升高HUVECs細胞ROS產物累積，ROS陽性細胞比例(圖2A、2B，P<0.001)，而GBE50處理后，HUVECs ROS陽性細胞比例明顯下降(P<0.05)。因此，GBE50可顯著降低HUVECs內ROS產物生成水平。

2.3 高糖環(huán)境下GBE50升高HUVECs中GSH的表達

隨后本研究通過CMAC熒光反應研究了HUVECs中GSH的表達情況。實驗結果顯示，相比于正常培養(yǎng)條件下細胞，高糖環(huán)境下HUVECs中GSH熒光強度顯著降低(圖3A、3B，P<0.001)，而GBE50處理后可顯著升高GSH的表達(P<0.01)。

2.4 高糖環(huán)境下GBE50降低HUVECs細胞自噬

為了研究GBE50對HUVECs細胞自噬的影響，本研究通過丙二醛(Malondialdehyde，MDA)標記HUVECs自噬空泡，通過流式細胞實驗篩選MDA陽性細胞。實驗結果顯示，高糖環(huán)境可顯著升高HUVECs中MDA熒光密度(圖4A、4B，P<0.001)，說明高糖環(huán)境增強了細胞正常自噬。而GBE50處理后，MDC陽性細胞數(shù)顯著降低(圖4B，P<0.01)。因此，GBE50可顯著降低HUVECs在高糖環(huán)境下的自噬水平。

注：A：HUVECs中的ROS產物含量；B：ROS陽性細胞百分比。與Glu5 mmol/L GBE50-相比，###P <0.001；與Glu30 mmol/L GBE50-相比，**P <0.01。圖2 高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs中ROS生成的影響Note. A， Representative flow cytometric analysis of ROS contents in HUVECs. B， Percentage of ROS-positive cells.###P<0.001vs Glu5mmol/LGBE50-,**P<0.01 vs Glu30mmol/LGBE50-.Figure 2 Effect of GBE50 on ROS content in HUVECs in a high glucose environment

注：A：GSH熒光染色示意圖；B：熒光密度統(tǒng)計圖。與Glu5 mmol/L GBE50-相比，###P <0.001；與Glu30 mmol/LGBE50-相比，**P <0.01。圖3 高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs中GSH表達的的影響Note. A， Representative immunofluorescence images of glutathione (GSH). B， Fluorescence intensity of GSH in HUVECs.###P<0.001vs Glu5mmol/LGBE50-,**P<0.01vs Glu30mmol/LGBE50-.Figure 3 Effect of GBE50 on GSH expression in HUVECs in a high glucose environment

注：A：MDC陽性細胞流式細胞結果示意圖；B：MDC陽性細胞比。與Glu5 mmol/L GBE50-相比，###P <0.001；與Glu30 mmol/L GBE50-相比，**P <0.01。圖4 高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs細胞自噬的影響Note. A, Representative flow cytometric analysis of MDC contents in HUVECs.B, Percentage of MDC-positive cells. ###P<0.001vs Glu5mmol/LGBE50-,**P<0.01vs Glu30mmol/LGBE50-.Figure 4 Effect of GBE50 on autophagy in HUVECs in a high glucose environment

2.5 高糖環(huán)境下GBE50降低HUVECs中LC3表達

為了進一步研究GBE50對HUVECs細胞自噬的影響，本研究通過免疫熒光實驗研究了微管相關蛋白1輕鏈3-β(microtubule-associated protein1light chain3-β,MAP1LC3-Ⅱ,LC3)的表達情況。免疫熒光實驗結果顯示，高糖環(huán)境下LC3熒光強度明顯升高(圖5A、5B，P<0.001)。而GBE50處理可顯著降低LC3熒光水平，統(tǒng)計結果顯示LC3陽性細胞比例明顯下降(圖5A、5B，P<0.01)。隨后，本研究使用蛋白印跡實驗觀察了LC3-II/LC3-I的表達水平，高糖處理時，LC3-II/LC3-I比值顯著增加而GBE50降低了LC3-II/LC3-I比值。以上結果進一步證明了GBE50可顯著降低細胞自噬水平。

注：A：LDC熒光染色示意圖；B：熒光密度統(tǒng)計圖；C：LC3-II/ LC3-I蛋白印跡實驗及其統(tǒng)計圖。與Glu5 mmol/L GBE50-相比，###P <0.001；與Glu30 mmol/L GBE50-相比，**P <0.01。圖5 高糖環(huán)境下GBE50對HUVECs中LC3表達的影響Note. A, Representative immunofluorescence images of LC3. B, Statistical results of LC-3 positive cells (%). C, Representative western blot of LC3-II/LC3-I and statistical results.###P<0.001 vs Glu5mmol/LGBE50-,**P<0.01 vs Glu30mmol/LGBE50-.Figure 5 Effect of GBE50 on LC3 expression in HUVECs in a high glucose environment

3 討論

本研究表明GBE50處理HUVECs能逆轉高糖環(huán)境對細胞的損傷作用，并能增強抗氧化能力。本研究結果顯示，GBE50對HUVECs的保護作用與降低細胞自噬水平相關。糖尿病是一組以慢性高血糖為主要特征的分泌代謝性疾病，主要分為Ⅰ型糖尿病Ⅱ型糖尿病和妊娠糖尿病[10]，近年來我國糖尿病的患病率正逐年提升。現(xiàn)在的研究認為，糖尿病是遺傳因素免疫功能和環(huán)境因素共同作用的結果[11]。由于患者體內長期較高的血糖水平而引起的一系列多系統(tǒng)器官慢性并發(fā)癥如視網膜病變、腎病、神經疾病、心臟疾病等[11-13]是現(xiàn)在臨床糖尿病主要面臨的挑戰(zhàn)。血管內皮作為血管保護屏障，最容易受到血液微環(huán)境變化的影響，長期暴露于高糖水平下可導致內皮細胞動態(tài)平衡紊亂[14]。

現(xiàn)在臨床用于治療和預防糖尿病血管病變的藥物效果仍然具有局限性，并且具有降低患者體重等副作用[15]。如今，抗氧化治療作為對抗糖尿病患者氧化損傷的一種方法已經引起了極大的關注，是接下來十年控制或預防糖尿病血管病變最有希望的候選藥物[16]。GBE50是從銀杏葉中提取的綜合活性成分，其主要成分為銀杏黃酮和銀杏內酯。最近的研究表明，GBE在中樞神經系統(tǒng)中具有廣泛的作用范圍。GBE能調節(jié)膽堿能神經元功能，起到抗氧化和清除自由基的作用，減輕細胞損傷。此外，銀杏葉提取物還能降低一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶-2的表達，并降低細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平[17]。沈建穎等[18]研究發(fā)現(xiàn)，GBE50可顯著降低缺氧引起的HUVECs內ROS水平并抑制細胞凋亡，對缺氧所致的內皮細胞功能障礙有一定的保護作用，然而GBE50在高糖環(huán)境引起的內皮細胞功能障礙中的作用并不清楚。

本研究通過高葡萄糖濃度建立細胞高糖環(huán)境，首先通過MTT法研究了GBE50對HUVECs細胞活性的影響。實驗結果顯示，GBE50可顯著提高高糖環(huán)境下HUVECs細胞活性。有研究表明高葡萄糖含量可誘導細胞內ROS的產生，導致內皮功能障礙甚至細胞凋亡。糖尿病中的高糖環(huán)境激活了葡萄糖代謝途徑，并導致細胞過氧化[19]。本研究實驗結果同樣顯示，在流式細胞實驗中，高糖環(huán)境下HUVECs中ROS陽性細胞比率明顯升高，而GBE50可顯著降低ROS生成。谷胱甘肽是細胞內主要的非酶抗氧化防御系統(tǒng)，可清除體內氧自由基[20]，保護許多蛋白質和酶等分子中的巰基。隨后本研究通過CMAC熒光標記HUVECs中GSH，實驗結果顯示，GBE50可顯著升高高糖環(huán)境下HUVECs中GSH含量。

在氧化條件下，氧化生物分子和受損的DNA可能觸發(fā)自噬機制和相關信號通路。自噬是一個動態(tài)的、維持生命的細胞降解過程，通過降解蛋白質和受損細胞器來保護細胞，而過度自噬將會引起細胞凋亡[21]。在高糖濃度引起的細胞應激中，自噬現(xiàn)象在早期階段產生[21]。隨后本研究通過MDA標記了細胞自噬空泡，評估GBE50對HUVECs細胞自噬的影響。流式細胞實驗結果顯示，GBE50可顯著降低HUVECs在高糖環(huán)境下MDA陽性細胞比率，說明細胞自噬水平下降。自噬反應啟動后，LC3-I與 LC3-II的相互轉化是自噬早期的標志[22]。隨后本研究通過免疫熒光實驗研究了LC3的表達情況。實驗結果顯示，GBE50可顯著降低HUVECs中LC3熒光水平，此結果進一步證明了GBE50降低了高糖環(huán)境下細胞自噬水平。

綜上，本研究揭示了GBE50可通過降低細胞自噬水平、降低ROS產物含量降低高糖環(huán)境對血管內皮細胞細胞活性的影響，本研究的研究為糖尿病血管損傷并發(fā)癥提供了新的治療手段。