臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)卵巢早衰家兔性激素、CYR61和CTGF表達(dá)的影響

張 娟，王 晶，周 麗，庹 平，王 剛，朱楚超

(1.中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430070； 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430065； 3.中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科，武漢 430070)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指40歲以下的婦女卵巢內(nèi)卵泡迅速減少，沒(méi)有或幾乎沒(méi)有卵泡殘留的一種疾病，臨床以無(wú)生育能力和閉經(jīng)為主要表現(xiàn)[1]。該病臨床發(fā)病率為1%，但一旦發(fā)病，常給患者帶來(lái)身體上和心理上的雙重打擊，患者會(huì)出現(xiàn)焦慮、抑郁等精神癥狀[2]。研究顯示，該病的發(fā)生可能與自身免疫、代謝、感染和醫(yī)源性因素等有關(guān)[3-4]。目前臨床上普遍的治療方法為激素替代療法[5]，雖能改善臨床癥狀，但很難恢復(fù)卵巢功能，而且長(zhǎng)期使用會(huì)增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，所以臨床上亟待尋求一種更加有效和安全的治療方法。研究闡明[6]，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UCMSCs)具有自我更新、多方向分化、促進(jìn)損傷修復(fù)和調(diào)節(jié)免疫等功能，并且有取材簡(jiǎn)單、免疫原性低、無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)。近來(lái)有研究顯示[7-8]，UCMSCs能依賴于旁分泌提高卵巢儲(chǔ)備，在治療POF中起到一定療效，是針對(duì)POF的非常有前景的一種療法。本實(shí)驗(yàn)研究以家兔為對(duì)象，觀察UCMSCs治療后富半胱氨酸蛋白61(CYR61)和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的表達(dá)、mRNA的表達(dá)和激素水平變化，探討研究UCMSCs對(duì)卵巢早衰的治療作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取普通級(jí)5月齡雌性未交配日本大耳兔10只，體重2.6～2.8 kg，購(gòu)自武漢市萬(wàn)千佳興生物科技有限公司[SCXK(鄂)2016-0011]，飼養(yǎng)于中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(鄂)2014-0082]，室溫為(22±2)℃，相對(duì)濕度為50～60%，12 h明暗交替光照，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片檢查確定其動(dòng)情周期正常后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2016020)，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

注射用環(huán)磷酰胺(Baxter Oncology GmbH，注冊(cè)證號(hào)：H20110407)；兔雌二醇酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博歐特生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：orb409999)；兔促卵泡激素酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博歐特生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：orb410001)；cDNA第一鏈合成試劑盒(RevertAid RT Reverse Transcription Kit，K1621，Thermo)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(SYBR FAST qPCR Master Mix，KK4604，sigma)；CRY61兔抗兔多克隆抗體(Novus，NB100-356)；CTGF兔抗兔多克隆抗體(Boster，BA0752)；GAPDH小鼠抗兔單克隆抗體(Abcam，ab8245)；流式抗體APC Mouse anti-Human CD29 (BD，559883)、PE Mouse anti-Human CD34(BD，550761)、PE Mouse anti-Human CD44 (BD，561858)、BB515 Mouse anti-Human CD45(BD，564585)；LightCycle 96型熒光定量PCR儀(ROCHE)；L600型離心機(jī)(湘儀儀器廠)；RM2016型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；BX51型奧林巴斯熒光顯微鏡；YD-6 L生物組織包埋機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

圖1 UCMSCs流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Changes of UCMSCs detected by flow cytometry

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備

根據(jù)團(tuán)隊(duì)前期研究[9]，以50 mg/kg劑量連續(xù)注射2 d是建立環(huán)磷酰胺(CTX)誘導(dǎo)家兔POF模型的最佳造模方式。故本實(shí)驗(yàn)采取CTX腹腔注射的方法建造POF模型，10只家兔均用CTX 50 mg/(kg·d)腹腔注射，連續(xù)注射2 d。造模后家兔出現(xiàn)不同程度脫毛，進(jìn)食減少，活動(dòng)反應(yīng)降低，體重下降等癥狀，并且采血檢查顯示有血清雌二醇(E2)水平下降，促卵泡生成素(FSH)水平上升。

1.3.2 分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法將10只家兔隨機(jī)分為模型組和治療組各5只。

1.3.3 干預(yù)

(1)UCMSCs培養(yǎng)及鑒定

取中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶，產(chǎn)婦簽署知情同意書(shū)，并報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所取標(biāo)本用PBS沖洗干凈，并剔除血管，將組織處理至1～2 mm，加入培養(yǎng)基(10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液)，置于5% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5～7 d后第1次傳代后每3 d按1∶3比例傳代，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。取第3代UCMSCs，制成單細(xì)胞懸液200 μL于EP管，分別加入抗體CD29-APC(20 μL)、CD34-PE(20 μL)、CD44 -PE(20 μL)、CD45-BB515(5 μL)，室溫避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示：貼壁細(xì)胞表達(dá)CD29和CD44，不表達(dá)CD34和CD45，為人體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。詳見(jiàn)圖1。

(2)干預(yù)治療

治療組5只POF家兔在造模一周后，通過(guò)耳緣靜脈注射5×106/mL的UCMSCs，每天注射2 mL，連續(xù)注射3 d。模型組注射等量的滅菌用水。

1.3.4 觀察指標(biāo)

(1)激素水平測(cè)定

UCMSCs治療后0 d、7 d、14 d和28 d，分別取模型組和治療組家兔各3只，抽取靜脈血查激素水平。

(2)卵巢組織CYR61和CTGF蛋白表達(dá)

采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)。治療28 d后，將兩組家兔處死后取一側(cè)卵巢，切取適量新鮮組織液氮速凍，放入-80℃冰箱中，后取100 mg剪切成細(xì)小的碎片，加入1000 μL RIPA裂解液，勻漿，充分裂解，12000 r/min離心5 min，取上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)樣本取40 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳，至溴酚藍(lán)剛出膠。將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，按150 mA恒流轉(zhuǎn)膜。稀釋一抗(CRY61∶1/200，CTGF：1/1000，GAPDH：1/2000)，4℃過(guò)夜，二抗(TBST溶解的5%脫脂牛奶)稀釋10000倍，室溫下30 min，TBST洗膜，滴加等體積混勻ECL顯影液，放入凝膠成像儀中曝光成像。以GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J 1.8.0軟件分析灰度值。

(3)卵巢組織CYR61和CTGF mRNA表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)。卵巢組織按Trizol法提取總RNA，測(cè)定純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行擴(kuò)增。引物：GAPDH：上游5’-TTCCACGGCAC GGTCAAG-3’，下游5’-ACTCGGCACCAGCATCAC-3’；CYR61：上游5’-GAAGTCTCCCGAAGCAGTCAG-3’，下游5’-GTCTCGCCGTCCTCACAG-3’；CTGF：上游5’-GGAGTGGGTGTGTGACGAG-3’，5’-CCGC AGGTCTTGGAACAGG-3’，采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

(4)免疫組化檢測(cè)卵巢組織CYR61和CTGF蛋白表達(dá)

除上述凍存新鮮組織外，剩余組織放入4%多聚甲醛常溫固定，石蠟包埋后，6 μm連續(xù)切片使用，切片組織脫蠟、抗原修復(fù)后封閉，滴加100 μL稀釋的一抗(CRY61∶1/200、CTGF：1/100)，4℃過(guò)夜，PBS沖洗。滴加100 μL生物素標(biāo)記二抗工作液(1/150稀釋)，37℃孵育30 min，PBS沖洗，孵育SABC，滴加DAB顯色液，室溫顯色。滴加200 μL蘇木素染色液孵育30 s，飽和磷酸氫二鈉溶液浸泡1 min返藍(lán)，以中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組激素水平比較

模型組和治療組在未治療前血清E2和FSH水平無(wú)差異，有可比性(P>0.05)。治療后家兔血清E2水平上升，F(xiàn)SH水平下降，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著時(shí)間出現(xiàn)周期性波動(dòng)；而模型組家兔一直處于低E2和高FSH水平，隨著時(shí)間未出現(xiàn)周期性的波動(dòng)。詳見(jiàn)表1、2和圖2、3。

2.2 兩組CYR61和CTGF蛋白表達(dá)比較

模型組CYR61和CTGF蛋白表達(dá)較低，分別為0.390±0.040和0.186±0.054，治療組蛋白表達(dá)量明顯增多，分別為0.756±0.085和0.693±0.098，與模型組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tCYR61=8.688，P<0.05；tCTGF=10.142，P<0.05)，見(jiàn)圖4和圖5。

2.3 兩組CYR61和CTGF mRNA表達(dá)比較

模型組CYR61和CTGF mRNA表達(dá)水平較低，分別為0.003±0.001和0.002±0.001，而治療組mRNA的表達(dá)水平明顯升高，分別為0.010±0.001和0.016±0.002，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tCYR61=38.156，P<0.05；tCTGF=14.646，P<0.05)，詳見(jiàn)圖6。

表1 兩組不同采血點(diǎn)E2水平比較

注：F組間=321.914，P組間<0.001；F時(shí)間=51.745；P時(shí)間<0.001；F交互=186.620，P交互<0.001。

Note.Fintergroup=321.914,Pintergroup<0.001.Ftime=51.745.Ptime<0.001.Finteraction=186.620,Pinteraction<0.001.

表2 兩組不同采血點(diǎn)FSH水平比較

注：F組間=694.561，P組間<0.001；F時(shí)間=33.990；P時(shí)間<0.001；F交互=126.616，P交互<0.001。

Note.Fintergroup=694.561,Pintergroup<0.001.Ftime=33.990.Ptime<0.001.Finteraction=126.616,Pinteraction<0.001.

圖2 兩組不同采血點(diǎn)E2水平比較Figure 2 Comparison of E2 levels at different blood collection points in the two groups

圖3 兩組不同采血點(diǎn)FSH水平比較Figure 3 Comparison of FSH levels at different blood collection points in the two groups

圖4 兩組家兔卵巢組織內(nèi)CYR61和CTGF蛋白表達(dá)(1-5：治療組，6-10：模型組)Figure 4 Expression of CYR61 and CTGF in ovarian tissue of rabbits (1-5， treatment group. 6-10, model group)

圖5 兩組家兔卵巢組織內(nèi)CYR61和CTGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Figure 5 Comparison of relative expression levels of CYR61 and CTGF in ovarian tissues of rabbits

2.4 兩組免疫組化檢測(cè)結(jié)果比較

圖7、8可知，CYR61和CTGF蛋白表達(dá)在模型組較少，散在分布，平均光密度值分別為(0.166±0.009)和(0.193±0.008)；治療組表達(dá)明顯增多，呈深棕色顆粒狀，主要表達(dá)在顆粒細(xì)胞和卵泡細(xì)胞膜，在卵泡細(xì)胞膜處更是呈深棕色環(huán)狀，平均光密度值分別為(0.222±0.030)和(0.224±0.014)，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tCYR61=3.981，P<0.05；tCTGF=4.111，P<0.05)。

圖6 兩組家兔卵巢組織內(nèi)CYR61和CTGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Figure 6 Comparison of relative expression levels of CYR61 and CTGF mRNA in ovarian tissues of rabbits

注：A：模型組;B：治療組，CYR61檢測(cè)；C：模型組;D：為治療組,CTGF檢測(cè)。圖7 兩組家兔卵巢組織內(nèi)CYR61和CTGF表達(dá)Note. A, Model group. B, Treatment group, CYR61. C, Model group. D, Treatment group, CTGF.Figure 7 Expression of CYR61 and CTGF in ovarian tissue of rabbits

圖8 兩組家兔卵巢組織內(nèi)CYR61和CTGF表達(dá)平均光密度值比較Figure 8 Comparison of mean optical density values of CYR61 and CTGF expression in ovarian tissue of rabbits

3 討論

隨著社會(huì)的發(fā)展，各種間充質(zhì)干細(xì)胞越來(lái)越多的被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，也是現(xiàn)代再生醫(yī)學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。其中UCMSCs取材簡(jiǎn)單，來(lái)源豐富，無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議，被認(rèn)為是同種異體移植的最佳來(lái)源[6-10]，UCMSCs是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，它能分化成許多種組織細(xì)胞，在醫(yī)學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景。現(xiàn)代研究表明，UCMSCs能夠在許多疾病的治療中起到一定作用，如在治療糖尿病方面[11]，UCMSCs能阻斷相關(guān)的炎癥因子和炎癥激活，有效緩解胰島素抵抗；在治療肝方面[12]，UCMSCs能夠通過(guò)調(diào)節(jié)miR-20來(lái)調(diào)控Caspase-3等活性因子減輕細(xì)胞凋亡和基因異常表達(dá)，從而改善肝臟缺血再灌注損傷；在治療骨骼方面[13]，UCMSCs聯(lián)合骨膠原蛋白能夠促進(jìn)骨再生，修復(fù)腰椎板缺損。多項(xiàng)研究闡明，人體間充質(zhì)干細(xì)胞能對(duì)CTX誘導(dǎo)的卵巢損傷起到一定的修復(fù)作用。Mchamed等[14]的動(dòng)物試驗(yàn)研究就顯示，人體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠刺激POF小鼠卵巢內(nèi)卵泡的生成和改善相關(guān)激素水平。另有一項(xiàng)臨床研究顯示[15]，在自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后，2例POF患者第三個(gè)月恢復(fù)了月經(jīng)，1例POF患者成功受孕并產(chǎn)下健康胎兒，充分表明應(yīng)用自體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)治療POF有很好的療效。

本實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用注射CTX建造POF模型，始終具有高FSH和低E2水平，生理學(xué)上能代表人類POF。有研究闡明[16]，雖然動(dòng)物卵巢結(jié)構(gòu)和激素周期和人體存在差異，但CTX誘導(dǎo)的動(dòng)物POF模型是目前該領(lǐng)域研究中最被接受的臨床前模型。本研究顯示經(jīng)UCMSCs治療后，POF家兔體內(nèi)的E2水平上升，F(xiàn)SH水平下降，并且在治療后恢復(fù)了周期性的波動(dòng)，證實(shí)其治療有效。最近的證據(jù)表明[17]，間充質(zhì)干細(xì)胞的作用不是直接恢復(fù)受損的細(xì)胞，而是通過(guò)阻礙和抑制異常的免疫反應(yīng)來(lái)幫助組織再生，并傳遞生長(zhǎng)因子來(lái)實(shí)現(xiàn)修復(fù)的。CYR61和CTGF均為CCN家族的一員，為細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白[18]。生理情況下，CYR61保持低表達(dá)維持機(jī)體生理需要，但炎癥刺激等多種因素均可導(dǎo)致CYR61表達(dá)增加；高表達(dá)的CYR61能分泌到胞外基質(zhì)，通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合，起到促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、血管形成以及組織損傷修復(fù)等多種作用[19]。相關(guān)研究顯示[20]，高表達(dá)CYR61的人子宮內(nèi)膜血管周圍細(xì)胞移植能促進(jìn)子宮部分全層切除術(shù)后大鼠子宮血管生成以及內(nèi)膜和肌層再生，提高大鼠的妊娠率。CTGF具有促細(xì)胞增殖、遷移及分化等作用，與CYR61共同參與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)研究中，治療后CYR61和CTGF蛋白和mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，表達(dá)的主要部位為顆粒細(xì)胞和卵泡細(xì)胞膜，表明其具有協(xié)同作用，共同參與UCMSCs對(duì)POF的治療調(diào)節(jié)機(jī)制。研究顯示，CYR61和CTGF除自身能促進(jìn)新生血管生成外，還能一起上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)間接促進(jìn)血管生成[21]。另有研究闡明，E2等雌激素能上調(diào)CTGF表達(dá)，并且此過(guò)程受FSH的負(fù)調(diào)控[22]。UCMSCs也能夠分泌VEGF，抑制次級(jí)卵泡和囊狀卵泡凋亡，促進(jìn)血管生成；也能分泌多種生長(zhǎng)因子，逆轉(zhuǎn)CTX阻斷的E2對(duì)FSH的負(fù)反饋?zhàn)饔茫柚股L(zhǎng)卵泡過(guò)度耗竭，最終改善卵泡的發(fā)育[23-24]。

綜上所述，UCMSCs對(duì)POF具有一定的治療作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)卵巢內(nèi)E2和FSH水平以及上調(diào)CYR61和CTGF在局部組織內(nèi)的表達(dá)，進(jìn)而影響VEGF等表達(dá)，促進(jìn)新生血管的形成，從而促進(jìn)卵泡再生和組織修復(fù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。