ATG5/7參與METH和HIV-1Tat蛋白協同誘導的樹鼩中腦神經元自噬

李 娟，晏和熙，李紅梅，呂麗瓊，曾曉鋒，代解杰

(1.昆明醫科大學基礎醫學院，昆明 650500； 2.中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所，實驗樹鼩標準化與應用研究云南省創新團隊，昆明 650118； 3.昆明醫科大學法醫學院，昆明 650500)

眾所周知，HIV感染和毒品濫用是當今世界上嚴重兩大的社會和公共衛生問題，目前臨床使用的抗逆轉錄病毒療法(cART)雖然改善了HIV感染者的健康狀況，但是不能改善HIV相關神經認知障礙(HAND)的癥狀，因此，HAND仍然是HIV感染者面臨的主要問題之一[1]，而毒品的濫用增加了HAND的風險。METH即甲基苯丙胺(Mmethamphetamine, METH)也稱為“冰毒”，會影響中樞神經系統功能的正常發揮。甲基苯丙胺濫用常常伴隨HIV病毒的感染，而且甲基苯丙胺可以影響HIV病毒的復制和發病機制[2]，這些HIV感染者也表現出更大的神經損傷和更高的認知能力下降。

HIV-1Tat蛋白是一種病毒蛋白，可以通過誘導神經細胞凋亡、自噬以及神經突觸的改變，產生神經毒性，是HAND的主要致病因子之一[3-4]。而METH能夠刺激多巴胺神經元產生活性氧分子(ROS)從而導致谷氨酸代謝異常[5]，因而產生神經毒性。之前我們報道，METH和HIV-1Tat蛋白可以顯著增加神經細胞凋亡和自噬的風險，兩者具有協同作用[6-7]，然而這種協同作用的分子機制還不清楚。

細胞死亡可以是偶然死亡，也可以是程序化死亡，都是為了維持細胞內環境的穩定。程序性細胞死亡依賴于特定的信號通路，導致裂解或非裂解形態，有凋亡(apoptosis)和自噬(autophagy)兩種形式。自噬意即細胞的自我吞噬，是通過降解和回收細胞成分來維持細胞穩態，需要超過30多種自噬相關蛋白(ATG)來進行調節這個過程[8]。樹鼩(Tupaia Belangeri)雖然是一種小型哺乳動物，但是因為它與人類的親緣關系相近，一些研究人員甚至將樹鼩歸類為一種獨立的哺乳動物分類群[9]，而且樹鼩大腦較發達，因此很多研究者將樹鼩作為研究人類神經系統疾病的動物模型。

之前我們已經報道METH和HIV-1Tat蛋白能夠協同誘導樹鼩中腦神經元自噬，而ATG5/7蛋白參與了兩者誘導的自噬，METH和HIV-1Tat蛋白誘導的細胞氧化應激可能是引起自噬的基本原因[7]。據研究應激誘導的細胞自噬初期可能會起到保護細胞的作用，但應激狀態持續，細胞無法適應這種應激，則會引起細胞凋亡[10]。ATG5和ATG7作為兩種重要的自噬相關蛋白參與了METH和HIV-Tat蛋白誘導的自噬，對于維持細胞的內環境有一定的作用，然而氧化應激持續進行時，細胞是如何調節自噬并不完全被了解。而本研究則進一步證實METH和HIV-1Tat蛋白通過增加ATG5/7基因的表達上調ATG5/7蛋白，進而調控兩者誘導的神經元自噬，探討自噬的潛在機制，揭示吸毒人員引起的艾滋病腦病的發病機制，對于尋找合適的藥物治療靶點有一定的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

中緬樹鼩滇西亞種(Tree Shrew, Tupaia Belangeri Chinesis)(新生3 d內)10只，普通級，雌雄各半，體重9.1～ 16.5 g，平均(13.1±1.2) g，選取身體虛弱，母樹鼩不給予哺乳、出生3 d內的乳樹鼩，由中國醫學科學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心提供，實驗動物生產許可證號[SCXK(滇)K2018-0002]，使用許可證號[SYXK(滇)K2018-0002]。同時中國醫學科學院醫學生物學研究所實驗動物福利倫理委員會批準了本研究(DWSP2017053)，實驗過程中按照實驗動物使用的3R原則，所有樹鼩給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

LC3B rabbit Ab(2775s)，Beclin-1 rabbit Ab(3738s)，Anti-rabbit IgG-HRP(7074s)，Anti-mouse IgG-HRP(7076s)購于Cell Signaling Technology公司。ATG5 rabbit Ab(ab108327)，ATG7 rabbit Ab(ab133528)購于abcam公司。Anti-β-Actin Mouse Ab(A1978)購于Sigma公司；胎牛血清(1739464)，B27 supplement(50X)(17504-044)，Pen Strep(15140-122)，0.25% Trypsin-EDTA(25200-056)，Neurobasal-a 培養基(10888-022)購于Gibco公司；DMEM/F12 培養基(SH30023.01)購于Hyclone公司；Western Blot 相關試劑購于上海碧云天生物技術有限公司；HIV-Tat蛋白Clade-B(HIV-129-c)購于PROSPEC公司，甲基苯丙胺(化學對照品，純度>99%，Methylamphetamine)(171212-200603)購于中國藥品生物制品檢定所；RNAzol RNA提取試劑(RN190)購于MRC公司，RT-PCR一步法RT-PCR試劑盒SYBR Green染料法(1708892)購于BIO-RAD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樹鼩中腦神經元分離、培養

樹鼩中腦神經元分離、培養方法見參考文獻[7]。

1.3.2 引物設計、合成

從NCBI數據庫中查找ATG5和ATG7的序列，設計qRT-PCR檢測引物, ATG5引物序列正向：5’- GCCATCAATCGGAAACTCAT-3’，反向：5’-CACAGGACGGAACAGCTTCT-3’，ATG7引物序列正向：5’-GCCCTGTGTCTTCCAGAGAG-5’，反向：5’- AGTGCCGTGACTCCTTCTGT-3’；同時以GADPH作為內參基因，GAPDH引物序列正向：5’-CAT GGC ACC GTC AAG GCT GAG AA-3’，反向：5’-CAG TGG ACT CCA CGA CGT ACT CA-3’，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.3 RNA提取以及熒光定量RT-PCR

采用TRIzol 法提取樹鼩中腦神經元中的mRNA，并對其進行濃度和純度的測定。使用一步法SYBR Green熒光PCR進行RT-PCR反應，所得數據采用2-ΔΔCT法進行計算分析。

1.3.4 Western blot

用Western和IP裂解液提取蛋白，經BCA法測定蛋白濃度。取25 μg蛋白，經SDS-PAGE蛋白分離后，轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后加入一抗(LC3、Beclin-1、ATG5、ATG7，稀釋比例均為1∶1000，β-actin 稀釋比例為1∶2000)，4℃孵育過夜，用1×PBST 清洗干凈后，放入二抗中室溫孵育2 h，用ECL顯色液顯色，利用Image J軟件分析灰度值，每次實驗重復3次。

1.4 統計學方法

本實驗數據分析使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 6.00軟件，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，結果以P<0.05具有統計學意義。HIV-1Tat蛋白和/或METH誘導的Beclin-1、 LC3B、ATG5/7蛋白使用Bliss獨立模型(Bliss independence model)計算兩者是否具有協同效應，效應值< 1為協同(synergistic)=1 為疊加(additive)，> 1為拮抗(antagonistic)[11]。

2 結果

2.1 METH和HIV-1Tat蛋白協同誘導樹鼩中腦神經元自噬

根據之前研究結果[7]本文用HIV-1Tat蛋白(100 nmol/L)單獨 /聯合 METH(0.5 mmol/L)作用細胞24 h，檢測細胞中自噬蛋白Beclin-1和 LC3B蛋白的表達水平(圖1)。 METH和HIV-1Tat蛋白均可以提高細胞中Beclin-1和 LC3B蛋白的表達，與對照組相比，HIV-1Tat蛋白誘導細胞Beclin-1和LC3B蛋白的表達分別上升了2.2倍(P<0.05)和 1.8倍(P<0.001)；METH誘導細胞Beclin-1和LC3B蛋白表達分別上升了3.4 倍(P<0.05)和 2.3倍(P<0.01)。 METH和HIV-1Tat蛋白聯合作用細胞后，細胞中Beclin-1和LC3B蛋白明顯升高，高于其余組，有顯著性差異(P<0.001)。METH和HIV-1Tat蛋白兩者聯合誘導細胞Beclin-1和LC3B蛋白的效應值分別是0.77和0.76，具有協同效應。

2.2 ATG5和ATG7參與了兩者誘導的細胞自噬

本文檢測了細胞中自噬蛋白ATG5/7的表達水平，如圖2所示：給予細胞METH和HIV-1Tat蛋白治療后，細胞中ATG5/7蛋白表達量升高。HIV-1Tat蛋白單獨作用細胞后，細胞中ATG5/7蛋白表達比對照組分別上調了1.1倍(P<0.05)和1.0倍(P<0.01)，METH作用細胞后，細胞中ATG5/7蛋白表達比對照組上調了1.2倍(P<0.05)和1.0倍(P<0.01)，而兩者同時作用細胞后，細胞中ATG5/7蛋白表達量明顯上升，作用效應分別是0.84(ATG5)和0.64(ATG7)，具有協同效應。而PCR結果顯示(圖3)，單獨給予HIV-1Tat蛋白治療后，ATG5/7基因的表達量升高，分別是對照組的99倍(P<0.05)和129倍(P<0.01)；單獨應用METH治療后ATG5/7基因的表達量也升高，分別是對照組的114倍(P<0.01)和128倍(P<0.01)；HIV-1Tat蛋白和METH兩者聯合明顯上調ATG5/7的表達量，與單獨藥物組和對照組比，差異有顯著性，具有統計學意義。

注： A：WB結果；B： Beclin-1蛋白灰度值與β-action灰度值比值；C： LC3B蛋白灰度值與β-action灰度值比值。灰度值測定用Image J軟件，數據分析及作圖使用Graphpad Prism軟件。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與M+T組相比，# P<0.05，###P<0.001。圖1 METH和HIV-1Tat蛋白誘導細胞后Beclin-1和LC3B蛋白表達Note. A， The data were analyzed using western blotting. B， The ratio of Beclin-1/β-action. C， The ratio of LC3B/β-action. The data were quantified by Image J software, and displayed using a scatterplot with bars showing the means and individual data points of each column by Graphpad Prism software. Representative blot images are shown.Compared with control.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with M+T. #P < 0.05,### P<0.001.Figure 1 Cells were exposed to HIV-1Tat protein and/or METH for 24 h and the protein levels of Beclin-1 and LC3B were analyzed by Western blot.

注: A：WB結果；B：ATG5蛋白灰度值與β-action灰度值比值；C：ATG7蛋白灰度值與β-action灰度值比值。灰度值測定用Image J軟件，數據分析及作圖使用Graphpad Prism軟件。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與M+T組相比，# P<0.05，###P<0.001。圖2 METH和HIV-1Tat蛋白誘導細胞ATG5和ATG7蛋白表達Note. A, The data were analyzed using western blotting. B, The ratio of ATG5/β-action. C, The ratio of ATG7/β-action. The data were quantified by Image J software, and displayed using a scatterplot with bars showing the means and individual data points of each column by Graphpad Prism software. Representative blot images are shown.Compared with control.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with M+T,#P<0.05,##P<0.01.Figure 2 Cells were exposed to HIV-1Tat protein and/or METH for 24 h and the protein levels of ATG5 and ATG7 were analyzed by Western blot

注:與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與M+T組相比，#P<0.05，##P<0.01。圖3 METH和HIV-1Tat蛋白誘導細胞ATG5和ATG7基因表達Note. A, The expression levels of mRNA ATG5. B, The expression levels of mRNA ATG7. The data were calculated and analyzed by 2-ΔΔCT method, and displayed using a scatterplot with bars showing the means and individual data points of each column by Graphpad Prism software.Compared with control,*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001. Compared with M+T,# P<0.05, ##P<0.01. Figure 3 Cells were exposed to HIV-1Tat protein and/or METH for 24 h and the expression levels of mRNA ATG5 and ATG7

3 討論

HIV感染者濫用METH增加了HAND發生的風險。據研究，METH通過下降神經突觸前和突觸后蛋白降低HIV-1Tat轉基因(Tat-Tg)小鼠的工作記憶和空間記憶，并且服用METH的Tat-Tg小鼠在空間記憶方面具有明顯的缺陷[12]。METH和HIV-1Tat能協同增強大鼠和SH-SY5Y細胞(人神經母細胞瘤細胞)的氧化應激反應，從而損傷大鼠的血腦屏障，誘導細胞凋亡和自噬，增加神經毒性[13-14]。

哺乳動物的自噬可以在缺氧、饑餓、病毒侵入等應激情況下增強，有利于細胞的存活，但是過度自噬則會導致細胞死亡。在酵母和哺乳動物中，有兩種泛素樣(ubiquitin-like, UBL)蛋白的共軛系統利于噬菌體擴大延伸[15]，其中一個系統是ATG12-ATG5-ATG16復合體。在酵母中，ATG5依賴E1激酶而激活，而ATG7作為一種獨特的E1酶，激活ATG12并將其轉化為不同的E2酶[16]。研究發現ATG5/7依賴性自噬在嗎啡成癮以及神經元樹突調節中起著關鍵作用[17]。Zheng等[18]通過Ad-ATG5/7重組腺病毒轉染小鼠軟骨細胞后，發現ATG5/7蛋白可以通過PERK信號通路促進自噬。Yang等[19]認為METH通過AKT/mTOR信號通路調控神經細胞自噬，而天麻素能夠減輕其誘導的自噬，從而起到保護作用。在本研究中，METH和HIV-1Tat蛋白協同可以顯著上調ATG5/7基因的表達水平，從而調控蛋白表達促進細胞自噬，增加細胞毒性。

本研究的結果揭示METH和HIV-1Tat蛋白通過上調ATG5/7基因的表達，協同誘導樹鼩中腦神經元自噬，從而為了解HIV感染的METH吸毒患者神經認知障礙的分子機制提供了新的見解和理論依據。同時樹鼩的原代中腦神經元可以作為研究HIV-1Tat蛋白和METH自噬的一個模型，為進一步的研究提供一個新的方向。