小鼠非開胸式主動脈弓狹窄心衰模型的構建及評價

方明筍，金櫨帥，張利棕，馬全鑫，金 璐，郎佳麗，傅惠英，壽旗揚*

(1.浙江中醫藥大學動物實驗研究中心/比較醫學研究所，杭州 310053； 2.浙江中醫藥大學第二臨床醫學院/附屬第二醫院，杭州 310053； 3.浙江大學化學工程與生物工程學院，杭州 310027)

心力衰竭是臨床常見的疾病之一，有著較高的發病率和死亡率，流行病學調查結果顯示心力衰竭在我國的發病率在逐年上升，嚴重危害大眾健康[1-2]。臨床對于心力衰竭治療的研究也不勝枚舉，但至今還沒有特別理想的治療方案。就臨床研究而言，最基礎的就是要建立具有代表性的成功的實驗動物模型[3]。小鼠是模擬人類疾病模型最常用的實驗動物[4]，臨床上用于建立小鼠心衰模型的方法多樣，主要是通過化學藥物誘導和物理手術兩種方式，化學藥物誘導成功率不高，耗費時間較長。物理手術包括壓力超負荷心衰模型、容量超負荷心衰模型和心肌梗死后心衰模型[5-7]。主動脈弓狹窄術(transverse aortic constriction，TAC)是壓力超負荷誘導左心室肥大及心力衰竭最常用的手術方法[8]。當前TAC術使用的動物品系不一，且手術方法需開胸，小鼠手術創傷很大，死亡率很高，導致模型建立難度大且不穩定，術后心力衰竭病程進度不一[9-11]。因此本文采用改良的小鼠非開胸式TAC術，使用C57BL/6J小鼠建立心力衰竭模型，并對小鼠心力衰竭的病理進程進行分析觀察。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠30只，6～8周齡，體重(22±2) g，購自上海靈暢生物科技有限公司[SCXK(滬)2018-0003]；飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心[SYXK(浙)2018-0006]，溫度：(22±2)℃，濕度：50%～70%，12 h明暗交替，自由飲食。本實驗經過浙江中醫藥大學倫理委員會審批通過(ZSLL-2017-106)，本實驗嚴格遵守實驗動物法規及動物福利的相關要求，實驗過程中按照3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(杭州達文生物)，異氟烷(深圳瑞沃德)，Vevo 1100超高分辨率小動物超聲影像系統(加拿大Visual Sonics)，Nano Zoomer 2.0 RS 數字切片掃描設備(日本濱松)，鵝頸冷光源燈(深圳瑞沃德)，小鼠顯微手術器械(上海醫療器械)，恒溫手術保溫臺(美國Gaymar)，自制L型26G墊針。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型建立及鑒定

30只小鼠預飼養1周后進行手術，采用0.3%戊巴比妥鈉(75 mg/kg)腹腔注射麻醉，掐捏鼠尾，確保沒有反射以后胸部和頸部剃毛。使用醫用膠布將動物四肢和門齒固定于恒溫手術臺，溫度設定37℃，碘伏消毒手術區域。用眼科剪在小鼠頸部和胸部中線位置縱向切開皮膚0.5～1 cm。使用眼科鑷輕輕分離結締組織和氣管中線兩側肌肉。用眼科剪從鎖骨處開始切至第二肋骨(約5 mm)。使用顯微鑷將胸腺兩葉彼此分離，此時可清晰看到主動脈弓和兩條頸動脈。用顯微鑷從左頸總動脈和右無名動脈之間，主動脈弓下方輕輕穿過，夾住6-0尼龍縫合線小心拉出(結扎位置見圖 1)。將自制L型26G墊針防至主動脈弓旁，將主動脈弓與L型墊針結扎固定，打三個結確保結扎穩固，小心抽去墊針。主動脈弓狹窄成功后可觀察到右頸總動脈搏動顯著增強。簡單間斷縫合肌肉和皮膚，碘伏消毒傷口后置于保溫臺上恢復，蘇醒后放回籠具。假手術組方法一致，不結扎。術后3 d肌肉注射青霉素鈉，每只5000 U。術后一周應用Vevo 1100超高分辨率小動物超聲影像系統及MS400超聲探頭(探頭頻率：30 MHz)對主動脈弓部進行血流彩色超聲，檢測狹窄處血流速度。假手術組主動脈弓血流速度峰值在600～900 mm/s，TAC組主動脈弓狹窄處的血流速度峰值急劇升高，以假手術組血流速度峰值的兩倍(大于1600 mm/s)作為TAC術成功的判斷標準。

1.3.2 心臟超聲檢查

應用Vevo 1100超高分辨率小動物超聲影像系統及MS400超聲探頭(探頭頻率：30 MHz)，分別于術后4、8、12周進行超聲檢查小鼠心臟獲得M型超聲心動圖像，分析圖像獲得左室舒張末期前壁厚度(IVS；d)，左室舒收縮末期前壁厚度(IVS；s)，左室舒張末期內徑，左室收縮末期內徑，左室舒張末期后壁厚度(LVPW；d)，左室舒收縮末期后壁厚度(LVPW；s)，左心室收縮末期容積，左心室舒張末期容積，左心室校正重量，射血分數，短軸率，心輸出量，每搏輸出量(stroke volume，SV)等數據，分析連續3個心動周期，取其平均值。

1.3.3 左心室質量指數

實驗終點時，小鼠稱重后CO2安樂死，打開胸腔，取心臟，排盡心臟中血液，濾紙吸干去除左右心耳和主動脈弓，去除右心室游離壁，剩余部分稱重作為左心室重量(LW)。將LW/體重(BW)作為左心室質量指數。

1.3.4 病理組織學檢查

將心臟從正中部位橫向對切成兩部分，心尖部分放入中性甲醛固定，做常規石蠟包埋、HE染色和Masson染色，應用Nano Zoomer 2.0 RS數字切片掃描設備掃描病理切片，觀察心臟病理變化。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 TAC術小鼠的存活情況及并發癥

手術過程中死亡的主要原因是胸膜破損(死亡2只)；結扎時用力過度導致主動脈弓破裂(死亡1只)；抽去墊針時主動脈弓破裂(死亡1只)；縫合時損傷肋間動脈導致大出血(死亡1只)。術后一周內部分動物出現頭頸部水腫(死亡1只)，其余動物自行緩解。術后1周總存活率為75%(18/24)。假手術組6只全部存活。

2.2 模型鑒定

術后1周應用超聲多普勒檢測主動脈弓狹窄處血流速度，TAC組血流速度峰值均大于1600 mm/s(圖2)。

2.3 左心室質量指數

TAC術后不同時期BW、LW和LW/BW值的比較結果如圖3所示。由圖可見BW、LW及LW/BW值隨時間逐漸升高，與假手術組比，TAC術后4周均有非常顯著性差異(P<0.001)，且TAC術后4周、8周、12周LW/BW均有非常顯著性差異(P<0.01)。

圖1 主動脈弓狹窄部位示意圖Figure 1 Schematic diagram of aortic arch stenosis

注：A：假手術組小鼠主動脈弓部血流彩色超聲;B：假手術組小鼠主動脈弓部脈沖多普勒血流頻譜;C: TAC術后小鼠主動脈弓部血流彩色超聲;D：TAC術后小鼠主動脈弓部脈沖多普勒血流頻譜。圖2 TAC術后模型鑒定Note. A, Color ultrasound of aortic arch blood flow in mice in the sham-operatedgroup. B, Pulse Doppler flow spectrum of aortic arch in the sham-operatedgroup. C, Color ultrasound of aortic arch blood flow in mice after TAC. D, Pulse Doppler flow spectrum of aortic arch in mice after TAC.Figure 2 Model identification after TAC

注：與假手術組(Sham)比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與TAC術后4周比#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與TAC術后8周比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3 術后不同時期體重(BW)、左心室重量(LW)、左心室質量指數的比較Note. Compared with the sham-operated group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the 4 week after TAC group,#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001. Compared with the 8 week after TAC group,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.Figure 3 Comparison of body weight (BW), left ventricular weight (LW),left ventricular mass index at different time points after operation

2.4 TAC術后不同時期心臟超聲檢查

分別在TAC術后4周、8周、12周對小鼠做心臟超聲檢查，如圖4，可見心室明顯增厚。由心超分析得到各指標檢查結果如圖5所示，統計分析發現，與假手術組對比，術后4周小鼠左室舒張末期前壁厚度，左室收縮末期前壁厚度，左心室校正重量，心率，心輸出量等均有非常顯著性差異(P<0.01)。術后8周小鼠較假手術組，左室收縮末期內徑，左室舒收縮末期后壁厚度，射血分數，短軸率，左心室收縮末期容積等也出現非常顯著性差異(P<0.01)。至術后12周，對比假手術組，左室舒張末期內徑，左室收縮末期內徑，左心室舒張末期容積等進一步變化，具非常顯著性差異(P<0.01)。

2.5 TAC術后不同時期心肌病理組織學檢查

TAC術后4周、8周、12周對小鼠心肌做病理組織學檢查，較假手術組，心肌組織不同程度發生變化。心肌HE染色結果如圖6所示，術后不同時期心臟體積不同程度增大。如圖6可見假手術組心肌纖維排列緊密整齊，細胞核形態正常，未見異常；TAC術后4周、8周、12周可見不同程度的心肌纖維不規則排列，斷裂溶解，肌纖維間間隙增大，且術后12周明顯可見病變組織。

心肌Masson染色結果如圖6所示，膠原纖維顯藍色，肌纖維顯紅色，細胞核顯黑藍色[12]。假手術組染色均勻，組織間無明顯膠原增生；TAC術后4周血管周圍明顯膠原增生；術后8周除血管周圍，心肌組織間也出現膠原增生；術后12周，血管周圍以及組織間可見大量膠原增生，心肌組織明顯纖維化，可見心臟已超負荷至發生病變。

3 討論

注：A：假手術組，B：TAC術后4周，C：TAC術后8周，D：TAC術后12周。圖4 假手術組與術后不同時期心臟超聲圖Note. A,Sham-operated group.B,4 weeks after TAC.C,8 weeks after TAC.D,12 weeks after TAC.Figure 4 Cardiac ultrasound of sham group and different periods after operation

注：與假手術組(Sham)比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與TAC術后4周比#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與TAC術后8 周比&P<0.05，&&P<0.01，&&&P<0.001。圖5 TAC術后不同時期心臟超聲檢查的比較Note. Compared with the sham-operated group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001. Compared with the 4 weeks after TAC group,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001. Compared with the 8 weeks after TAC group,&P<0.05,&&P<0.01,&&&P<0.001.Figure 5 Comparison of echocardiography in different periods after TAC

圖6 假手術組和TAC術后不同時期心肌組織鏡檢Figure 6 Microscopic examination of myocardial tissue in sham-operated group and different periods after operation

隨著社會老齡化的發展進程，各種心血管疾病高發，心率衰竭發病率逐年增高[13]。同時由于年輕人的不當作息，心力衰竭也在年輕一代高發，臨床上對該疾病也展開了許多的研究，但心衰成因機制多樣[14]，防治工作形勢依然嚴峻，至今未有對各類心衰均治療有效地理想的治療方案。而在心衰治療的研究上，構建具有代表性，與人類疾病接近的動物模型則是最堅實又關鍵的一步?，F階段，應用于臨床上的小鼠心衰造模方法也有很多，化學類藥物誘導和物理手術造模方法較為常用[5-7]。本實驗采用改良的TAC法造模，是考慮到物理方法相對于藥物誘導對小鼠生理功能的影響較小，實驗成本小，且成功率高等優點[15]。同時，采用改良的非開胸式的TAC法，可以降低因手術造成的死亡率。但在整個操作過程中，仍需格外小心，在本實驗中也出現了因操作誤差導致小鼠的死亡的現象，故在操作時的專注認真也是造模成功的關鍵之處。需要注意的是，在操作時，須注意不破壞胸膜，否則會導致動物氣胸死亡?？p合線結扎力度須適中，防止勒破主動脈弓。抽去墊針時要注意力度，以免主動脈弓破裂?？p合過程要盡可能小心，避免縫合針誤傷肋間動脈導致小鼠出血過多死亡。

按照改良的TAC法構建小鼠心力衰竭模型，從心動超聲成像，左心室質量指數，病理組織學檢查等多個角度來綜合評價心臟功能及心衰程度，多方位驗證該方法是否可行。心超多項與心衰相關指數呈顯著性差異，如左心室舒張期、收縮期前壁厚壁均顯著性增厚，左室內徑在術后12周也顯著性增大，左心室質量增大，左心室質量指數顯著性增加容積增大，說明在主動脈弓縮窄后，導致心室(舒張期或和收縮期)負荷過重，心室異常肥大；射血分數和短軸率顯著性減小，均顯示心肌收縮功能受損[16]。每搏輸出量在術后4周增大，至術后12周開始降低，顯示心臟在TAC術后12周開始功能衰退。同時心肌組織病理學檢查結果明顯可見心肌不同程度病變，且采用HE染色和Masson染色兩種方法，互相補充，通過HE染色，觀察心肌纖維的形態、排列[17]，Masson染色進一步觀察心肌組織的膠原增生等組織異常變化[18]。綜上，各角度共同驗證實驗采用TAC法建立的小鼠心衰模型成功，可進一步進行后續的實驗，探究治療心衰有效的治療方案，造福于人類社會。