地黃配方顆粒高效液相色譜指紋圖譜及紅外圖譜研究*

潘廣洲

（山東省聊城市食品藥品檢驗檢測中心，山東 聊城252000）

中藥配方顆粒因免煎煮、服用方便、易于儲運等優(yōu)點應用廣泛，成為中藥制劑工藝改進的一個研究方向[1]。但中藥配方顆粒的科學性及與中醫(yī)傳統(tǒng)用藥理論的一致性，仍是當今研究的熱點[2]。配方顆粒是對湯劑的改革，湯劑是諸藥合煎，配方顆粒是一味中藥單獨煎提，中藥配方顆粒能否替代飲片應用于臨床仍值得探討[3-4]。由于國家藥品監(jiān)督管理局無審批中藥配方顆粒的程序，也未制訂相關國家法定標準，各省對中藥配方顆粒的政策把握差異很大。在山東省，中藥配方顆粒屬監(jiān)管空白地帶。為此，本研究中參考了地黃指紋圖譜[5-12]和地黃配方顆粒指紋圖譜[2，13]及其地黃配方顆粒紅外快速鑒別[14-15]，建立了地黃配方顆粒的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜和紅外光譜，旨在為地黃配方顆粒質量的有效監(jiān)管提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Aglient 1260型高效液相色譜儀（美國Aglient公司，配有DAD檢測器，安捷倫色譜工作站）；Thermo Nicolet380型FT-IR紅外光譜儀（昆山市超聲儀器有限公司，配有OMNIC工作站，KQ-500GVDC型雙頻恒溫數控超聲波）；Metler AE240型電子天平（Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，Thermo Fisher公司）；超純水、甲醇（優(yōu)級純）、溴化鉀（分析純）均由天津市大茂化學試劑廠提供；梓醇對照品（批號為110808-201711）、毛蕊花糖苷對照品（批號為111530-201713）均由中國食品藥品檢定研究院提供。樣品：生地黃配方顆粒（北京A廠3批，批號分別為18008071，17023561，18006191；廣東B廠13批，批號分別為7110263，7116533，8010323，8015383，7052562，7079091，7090242，7091632，7102092，7116392，7120862，7120882，7116543；廣東C廠3批，批號分別為1803008S，1804001S，1803003C；江蘇D廠3批，批號分別為1710152，17112421，18030211；四川E廠1批，批號為18020038）。熟地黃配方顆粒（廣東C廠3批，批號分別為1803004S，1803006S，1802001W；四川E廠2批，批號分別為170880026，17110043）。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫表

2.1.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取毛蕊花糖苷對照品約10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。取梓醇對照品約12.5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，精密量取上述毛蕊花糖苷對照品溶液1 mL，再加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取樣品適量，研細，取約0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密量取50%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 方法學考察

精密度試驗：取同一批（批號為7110263）樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖。結果以梓醇為參比峰，各共有峰相對峰面積的RSD均小于5%（n=5），相對保留時間的RSD均小于2%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為7110263）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，3，6，9，12，24 h時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果以梓醇為參比峰，各共有峰相對峰面積的RSD均小于5%（n=6），相對保留時間的RSD均小于2%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批（批號為7110263）樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果以梓醇為參比峰，各共有峰相對峰面積的RSD均小于5%（n=6），相對保留時間的RSD均小于2%（n=6），表明方法重復性良好。

2.1.4 梓醇和毛蕊花糖苷含量測定

取28批樣品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算樣品中梓醇和毛蕊花糖苷的含量及其梓醇/毛蕊花糖苷（f）。詳見表2。

表2 樣品含量測定結果及二者的比值（f）

2.2 指紋圖譜的建立及相似度評價

取28批樣品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，詳見圖1。采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012年版）對23張地黃配方顆粒指紋圖譜和5張熟地黃配方顆粒指紋圖譜進行分析。經全譜匹配，共確立13個共有峰，共生成指紋圖譜共有模式（平均值法，R）。計算相似度，結果各個批次的地黃配方顆粒相似度均大于0.9，而與熟地黃配方顆粒的相似度則小于0.8。

圖1 生地黃配方顆粒HPLC指紋圖譜

2.3 紅外光譜的建立

樣品制備：取供試品5 mg，與200 mg溴化鉀混合研磨壓片，壓力為15 MPa，壓片時間為3 min。壓片測定，獲得紅外光譜圖。詳見圖2。

圖2 生地黃配方顆粒IR光譜圖

紅外二階導數光譜：采用Thermo公司的OMNIC軟件中的求導功能，選擇13點平滑，獲得各個樣品的紅外二階導數光譜圖[14]。詳見圖3。

圖3 生地黃配方顆粒IR二階光譜圖

3 討論

3.1HPLC指紋圖譜

用梓醇、毛蕊花糖苷和其他共有成分的13個色譜峰作為特征峰。根據樣品測定結果，暫訂生地黃配方顆粒相似度不得低于0.9。地黃配方顆粒（不包括熟地黃配方顆粒）各批產品相似度均大于0.9。另外，HPLC指紋圖譜在梓醇峰附近與其他峰不易分開，如分不開就應減少供試品溶液的進樣量。通過計算HPLC指紋紋圖譜中梓醇、毛蕊花糖苷含量，發(fā)現(xiàn)梓醇、毛蕊花糖苷含量的比值是一個關鍵參數，記為f。由于地黃在加工炮制成熟地黃的過程中，毛蕊花糖苷會大量水解，造成熟地黃配方顆粒中毛蕊花糖苷降低，故f值能區(qū)分地黃和熟地黃配方顆粒。f值范圍熟地黃為0～8.55，生地黃配方顆粒為12.94～172.52。以10為閾值可有效區(qū)分熟地黃配方顆粒和生地黃配方顆粒。

3.2 紅外光譜

未經求導處理的普通紅外光譜，特征性不明顯。經過二階求導后的紅外光譜差異較大。選取770，800，870，920，985，1 080，1 159，1 403（1 415），1 465，1 591 cm-1作為生地黃配方的特征峰，允許的誤差范圍為±5cm-1，其中1 403 cm-1和1 415 cm-1作為1個峰，因發(fā)現(xiàn)這個峰是由于壓片導致的峰的移動。以上10個峰至少要出現(xiàn)9個才可判定為生地黃配方顆粒。選取708，771，800，820，866，917，990，1 158，1 402（1 415），1 465 cm-1作為熟地黃配方顆粒的特征峰，允許誤差范圍為±5 cm-1，其中1 403 cm-1和1 415 cm-1作為1個峰。以上10個峰至少要出現(xiàn)9個才可判定為熟地黃配方顆粒。其中，生地黃配方顆粒和熟地配方顆粒的主要區(qū)別是熟地配方顆粒在708cm-1和820cm-1處同時有吸收。

以上方法可很容易地區(qū)分生地黃配方顆粒和熟地黃配方顆粒。但紅外光譜的二階導數與參考文獻[14]的數值差異較大，值得進一步探討。