硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑微生物限度檢查方法的建立和驗證

雷春華，王明巧，2，3，黃潔瑕，2，3，肖海文，2，3，李雪梅，林文輝，2△

（1.廣東同德藥業有限公司，廣東 湛江524018；2.國家中藥現代化工程技術研究中心·藥用植物油研究＜湛江＞分中心，廣東 湛江524018；3.湛江市明德醫藥科技有限公司，廣東 湛江524018）

硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑為葛蘭素史克公司產品萬托林（Ventolin）的仿制藥，臨床主要用于緩解哮喘或慢性阻塞性肺疾病（可逆性氣道阻塞疾病）患者的支氣管痙攣，以及預防急性運動誘發的哮喘，或其他過敏原誘發的支氣管痙攣[1]。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0111中吸入制劑要求，吸入制劑在生產和貯藏期間微生物限度應符合要求。本研究中根據2015年版《中國藥典（四部）》（通則1105及通則1106）非無菌產品微生物限度檢查方法，建立并驗證其微生物限度檢查方法，對3批產品進行方法適用性試驗。現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SWCJ-A型凈化工作臺（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）；YP5002型電子天平（上海佑科儀器有限公司）；BPH-9162型精密恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SHP-250型智能生化培養箱（上海三發科學儀器有限公司）；LT-CPS80C型立式壓力蒸汽滅菌器（立德泰＜上海＞科學儀器公司）；SPX-250B型生化培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；HTY-601型集菌儀（杭州泰林生物技術設備公司）。

1.2 材料

標準菌種：金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均購自中國食品藥品檢定研究院。

培養基：胰酪大豆胨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨液體培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基、沙氏葡萄糖液體培養基、麥康凱液體培養基、麥康凱瓊脂培養基、腸道菌增菌液體培養基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基，均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

試藥：硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑（廣東同德藥業有限公司，批號分別為20160201，20160202，20160301）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試液制備

需氧菌、霉菌和酵母菌：取60瓶供試品，置-20℃冰箱內冷凍約1 h，取出，迅速消毒品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆1個小孔，放至室溫，并輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，然后取供試品10 mL，加無菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，搖勻，制成1∶10的供試液。用同一稀釋液將1∶10供試液同法稀釋成1∶20的供試液。

控制菌：取供試品10 mL，加無菌胰酪大豆胨液體培養基至100 mL，搖勻，制成1∶10的供試液。混勻，置20～25℃培養2 h。

2.1.2 菌液制備

需氧菌、霉菌和酵母菌：取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養物，用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液或無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養物加人3～5 mL含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液或無菌0.9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫。采用適宜方法吸出孢子懸液置無菌試管內，用含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液或無菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。作為做活菌計數，備用。

控制菌：將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養基中或在胰酪大豆胨瓊脂培養基上，30～35℃培養18～24 h，取培養物1mL，用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液。

2.2 需氧菌、霉菌和酵母菌總數計算方法適用性試驗

2.2.1 需氧菌[2-6]

試驗組：取1∶20供試液9.9mL，加入不大于1000cfu銅綠假單胞菌菌液0.1 mL，混勻，置100 mL 0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，使每張濾膜所濾過的供試液中含銅綠假胞菌不大于100 cfu，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，取出濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上，倒置30～35℃培養3 d，計數試驗組的菌落數。每株試驗菌制備2張膜。按上述方法同法操作金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉。

菌液對照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9mL，加入不大于1000cfu銅綠假單胞菌菌液0.1mL，混勻，置100 mL 0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，使每張濾膜所濾過的供試液中含銅綠假單胞菌不大于100 cfu，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，然后取出濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上，倒置30～35℃培養3 d，計數菌液對照組的菌落數。每株試驗菌制備2張膜。按上述方法同法操作金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉。

供試品對照組：取1∶20供試液9.9 mL，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，混勻，置100 mL 0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，然后取出濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上，倒置30～35℃培養3 d，計數供試品的需氧菌總數。平行制備2張膜。

2.2.2 霉菌和酵母菌[2-6]

試驗組：取1∶20供試液9.9mL，加入不大于1000cfu白色念珠菌菌液0.1 mL，混勻，置100 mL0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，使每張濾膜所濾過的供試液中含白色念珠菌不大于100 cfu，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，然后取出濾膜，菌面朝上，貼于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，倒置20～25℃培養5 d，計數試驗組的菌落數。每株試驗菌制備2張膜。同法操作黑曲霉。

菌液對照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 mL，加入不大于1 000 cfu白色念珠菌菌液0.1 mL，混勻，置100 mL 0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，使每張濾膜所濾過的供試液中含白色念珠菌不大于100 cfu，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，然后取出濾膜，菌面朝上，貼于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，倒置20～25℃培養5 d，計數菌液對照組的菌落數。每株試驗菌制備2張膜。同法操作黑曲霉。

供試品對照組：取1∶20供試液9.9 mL，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，混勻，置100 mL 0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，然后取出濾膜，菌面朝上，貼于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，倒置20～25℃培養5 d，計數供試品的霉菌和酵母菌總數。平行制備2張膜。

2.2.3 回收率[7]

試驗菌株的回收率=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液組平均菌落數。結果見表1。3批樣品采用薄膜過濾法，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落比值均在0.5～2.0范圍內，結果表明，該方法可用于檢查本品的需氧菌、霉菌和酵母菌總數。

2.3 控制菌檢查方法適用性試驗[3-6，8-11]

2.3.1 耐膽鹽革蘭陰性菌

試驗組：取1∶10供試液10 mL置100 mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌菌液0.1 mL，取出濾膜，置100 mL腸道菌增菌液體培養基中，在30～35℃培養箱中培養24～48 h，取上述培養物，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～24 h，依法檢查。

陽性對照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100 mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌菌液0.1 mL，取出濾膜，置100 mL腸道菌增菌液體培養基中，30～35℃培養24～48 h，同試驗組操作。

陰性對照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，取出濾膜，置100 mL腸道菌增菌液體培養基中，30～35℃培養24～48 h，同試驗組操作。

2.3.2 大腸埃希菌

試驗組：取1∶10供試液10 mL置100 mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的大腸埃希菌菌液0.1 mL，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24 h，取上述培養物1 mL置100 mL麥康凱液體培養基中，42～44℃培養24～48 h，然后劃線接種于麥康凱瓊脂培養基的平板上，30～35℃培養18～72 h，依法檢查。

陽性對照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100 mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的大腸埃希菌菌液0.1 mL，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，在30～35℃培養箱中培養24～48 h，同試驗組操作。

陰性對照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次沖洗100 mL，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養24～48 h，同試驗組操作。

2.3.3 銅綠假單胞菌

試驗組：取1∶10的供試液10 mL置100 mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的銅綠假單胞菌液0.1 mL，過濾，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24 h，取上述培養物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72h，依法檢查。

陽性對照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100 mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的銅綠假單胞菌菌液0.1 mL，然后取出濾膜置100 mL的胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24 h，同試驗組操作。

陰性對照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24 h，同試驗組操作。

2.3.4 金黃色葡萄球菌

試驗組：取1∶10供試液10 mL置100 mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu金黃色葡萄球菌液0.1 mL，取出濾膜置100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24 h，取上述培養物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72h，依法檢查。

陽性對照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10mL置100mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的金黃色葡萄球菌液0.1mL，取出濾膜置100mL胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24h，同試驗組操作。

陰性對照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100mL無菌0.9%氯化鈉溶液中全量過濾，再用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24 h，同試驗組操作。

2.3.5 控制菌檢查方法驗證結果

結果見表2。上述方法相應的試驗組、陽性對照組檢出耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，陰性對照組無菌生長，表明硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑可用該方法檢查本品的耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌。

表2 控制菌檢查方法適用性試驗結果

2.4 供試品微生物限度檢查

采用薄膜過濾法，沖洗液為0.9%氯化鈉溶液；需氧菌、霉菌和酵母菌總數每張濾膜沖洗5次，每次100 mL；控制菌耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌每張濾膜沖洗3次，每次100 mL，依法測定。結果見表3。

表3 硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑微生物限度檢查結果

3 討論

硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑為吸入制劑，根據2015年版《中國藥典（四部）》通則1107中微生物限度檢查法的規定，硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑的需氧菌總數每1 mL不得超過102cfu，霉菌和酵母菌總數每1 mL不得超過10 cfu，耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌每1 mL不得檢出。