陽離子交換樹脂法降低殼聚糖酶解產(chǎn)物灰分的研究

杜雙有

（杭州澳醫(yī)保靈藥業(yè)有限公司，浙江 杭州310018）

殼低聚糖為低分子（chitooligosaccharide）殼聚糖，也稱殼寡糖，化學(xué)名為2-氨基-β-1，4-葡萄糖胺，分子式為（C6H11O4N）n，聚合度在25～30。殼低聚糖具有獨(dú)特優(yōu)越的生理活性和功能性質(zhì)，用途廣泛。在醫(yī)藥方面，殼低聚糖有多方面生理功能及抗腫瘤效果，特別是甲殼六糖有很強(qiáng)的生理活性，可作為早期腫瘤的治療藥物，有抑制腫瘤毛細(xì)血管內(nèi)皮的生成，致使腫瘤毛細(xì)血管不能加長而局限在局部的作用。但在醫(yī)藥生化領(lǐng)域應(yīng)用殼低聚糖，往往對灰分有較嚴(yán)格的要求，如膠囊劑和片劑一般要求灰分少于1%。由于原料殼寡糖在加工過程中脫鈣不完全及原料中重金屬含量過高，市場上可售殼聚糖的灰分常大于0.5%，再加上傳統(tǒng)的殼低聚糖的制備方法是對殼聚糖進(jìn)行化學(xué)降解或酶解，一種較經(jīng)典的工藝流程為，將殼聚糖加水混合均勻后加酸溶解，再加入纖維素酶制劑，經(jīng)過濾后得殼低聚糖溶液，最后經(jīng)噴霧干燥得殼低聚糖[1-2]。纖維素酶的引入[3]，若纖維素酶的灰分大于7.5%時(shí)，其得到的產(chǎn)品殼低聚糖的灰分就有可能超過1%的標(biāo)準(zhǔn)，帶來產(chǎn)品不合格的風(fēng)險(xiǎn)。市場上纖維素酶的灰分一般大于7.5%，為降低殼低聚糖的灰分，首先要降低纖維素酶的灰分，要了解纖維素酶中的灰分組成。湖南利爾康生物股份有限公司制備的食品添加劑纖維素酶，采用的是常用里氏木霉經(jīng)液體深層發(fā)酵和先進(jìn)的后提取工藝生產(chǎn)、精制而成[4]。包括以下步驟：種子培養(yǎng)→得種子液→發(fā)酵培養(yǎng)→粗提取→分離→純化→濃縮→干燥。在粗提取過程中，由于纖維素酶能溶解于水，且在一定濃度的鹽溶液中，其溶解度增加，故一般采取在稀鹽溶液中進(jìn)行纖維素酶的提取，常用的鹽溶液一般為加入約占纖維素酶量的8%氯化鈉鹽溶液，在將發(fā)酵生產(chǎn)的纖維素酶浸提出來，在后續(xù)生產(chǎn)過程中不去除氯化鈉鹽，這些氯化鈉鹽就形成了纖維素酶最主要的灰分。

強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂（濕計(jì)）是在交聯(lián)為7%的苯乙烯·二乙烯共聚體上帶有磺酸基（—SO3H）的陽離子交換樹脂，交換原理為：這類樹脂含有大量的強(qiáng)酸性基團(tuán)，如磺酸基—SO3H，易在溶液中離解出H+，故呈強(qiáng)酸性。樹脂離解后，本體所含的負(fù)電基團(tuán)，如SO3-，能吸附結(jié)合溶液中的其他陽離子。這2個(gè)反應(yīng)使樹脂中的H+與溶液中的陽離子互相交換[5-6]。樹脂在使用后要進(jìn)行再生處理，即用化學(xué)藥品使離子交換反應(yīng)以相反方向進(jìn)行，使樹脂的官能基團(tuán)恢復(fù)原來狀態(tài)，以供再次使用。強(qiáng)酸性陽離子樹脂是用強(qiáng)酸進(jìn)行再生處理，此時(shí)樹脂放出被吸附的陽離子，再與H+結(jié)合而恢復(fù)原來的組成。鑒于此，參考各類降低灰分研究的文獻(xiàn)資料[7-10]，本研究中采用把酶溶于水后，與型號為“Na+”的強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂（濕計(jì)）進(jìn)行離子交換處理，以去除纖維素酶中的灰分，進(jìn)而降低殼聚糖酶解產(chǎn)物（殼低聚糖）灰分。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司，檢測精度為0.1 mg）；SXL-1008型程控箱式電爐（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；GL-100型雙層圓盤電爐（嘉興市鳳橋電熱器廠）。

1.2 試藥

純化水（杭州澳醫(yī)保靈藥業(yè)有限公司制水車間自制）；強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂（濕計(jì)，浙江杭州雙林化工試劑廠）；食品添加劑鹽酸（杭州電化集團(tuán)有限公司，批號為20170623）；纖維素酶（湖南利爾康生物股份有限公司，批號為20171114-105，規(guī)格為每袋1 kg）；殼聚糖（青島云宙科技生物有限公司，批號為1709023）。

2 方法與結(jié)果

2.1 灰分測定

取大小適宜的坩堝置程控箱式電爐中，在（550±25）℃下灼燒0.5 h，冷至200℃以下后，取出，放入干燥器中冷卻至室溫，精密稱定，并重復(fù)灼燒至恒重（前后2次稱量相差不超過0.5 mg）。在恒重好的空坩堝中，加入2 g（精確至0.000 1 g）樣品，先在電熱板上以小火加熱，使樣品充分炭化至無煙，然后置程控箱式電爐中，在（550±25）℃灼燒4 h至灰化完全，冷至200℃以下后，取出，放入干燥器中冷卻至室溫，精密稱定（重復(fù)灼燒前后2次稱量相差不超過0.5 mg）。計(jì)算公式：灰分（%）=（W2-W空）/W1×100%，其中W空為空坩堝重（g），W1為樣重（g），W2為灼燒后稱重（g）。

2.2 方法選擇

由于在制備生產(chǎn)纖維素酶的過程中，引入淀粉作為載體，淀粉不易溶解，易形成糊狀，在使用動(dòng)態(tài)柱離子交換時(shí)會(huì)使交換柱堵塞，而用靜態(tài)浸泡交換法時(shí)[11-12]，只要控制好樹脂和纖維素酶液的比例，不斷攪拌，可使離子在樹脂與溶液中達(dá)到平衡，離子交換過程可順利進(jìn)行，故采用靜態(tài)浸泡離子交換法來處理。

2.3 陽離子交換樹脂法降低纖維素酶灰分的工藝方法

2.3.1 預(yù)處理

陽離子交換樹脂預(yù)處理：取烏合桶1個(gè)，加強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂15 kg，加純化水10 kg，再加濃HCl 4 500 mL，攪勻，pH=1，放置6 h。以一層紗布過濾，加50kg純化水?dāng)噭颍^5min過濾，如此重復(fù)8～9次，至pH=6～7，將烏合桶（內(nèi)樹脂浸于水中）放置，待用。

酶溶液預(yù)處理：在酶解前1d進(jìn)行，稱取纖維素酶5kg置烏合桶中，加水30 kg，攪拌，溶解，放置過夜。

纖維素酶液離子交換處理：將預(yù)處理好的酶液倒入已濾去水的樹脂中，放置0.5 h，中間攪拌數(shù)次。以一層紗布袋過濾，濾除樹脂，得經(jīng)離子交換樹脂處理好的酶液。

2.3.2 酶解

在夾層鍋中加入純凈水900 kg（50℃），加入經(jīng)陽離子交換樹脂處理好（或未經(jīng)陽離子交換樹脂處理過）的酶液，再加殼聚糖100 kg，攪拌均勻，再向夾層鍋內(nèi)緩緩加入食品級鹽酸36 kg，適當(dāng)攪拌，55℃保溫，酶解8 h，過濾，噴霧，得殼低聚糖。根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品灰分的測定方法（GB 5009.4-2016）測定殼低聚糖灰分。

2.4 纖維素酶與強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂用量設(shè)計(jì)

若纖維素酶未進(jìn)行陽離子交換樹脂處理，其產(chǎn)物殼低聚糖的灰分預(yù)計(jì)：批號為1709023殼聚糖的灰分為0.6%，100 kg殼聚糖的灰分為100 kg×0.6%=0.6 kg（Ⅰ）；批號為20171114-105纖維素酶的灰分為7.5%，5 kg纖維素酶的灰分為5 kg×7.5%=0.3375 kg（Ⅱ）；總灰分=Ⅰ+Ⅱ=0.375+0.6=0.975 kg。

100 kg殼聚糖酶解后得殼低聚糖約110 kg，灰分估計(jì)為0.975 kg÷110 kg=0.89%。

為去除纖維素酶中的灰分，需強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂（濕計(jì)）用量的計(jì)算[13]，強(qiáng)酸性陽離子樹脂基本參數(shù)見表1。

表1 強(qiáng)酸性陽離子樹脂基本參數(shù)

批號為20171114-105纖維素酶的灰分為7.5%，5 kg纖維素酶的灰分為5 kg×7.5%=375 g（Ⅰ）。

根據(jù)樹脂全交換容量（≥4.2 mmol/g）、鈉的摩爾質(zhì)量（M，23 g/mol）、含水量（46%～52%），計(jì)算纖維素酶中375 g的灰分的物質(zhì)的量為（以鈉計(jì)）：n=m/M=375 g÷23 g/mol=16.3 mol（Ⅱ）。其中，n為物質(zhì)的量，m為物質(zhì)的質(zhì)量，M為物質(zhì)的量。

需陽離子樹脂的量為16.3 mol÷4.2 mmol/g=3.88 kg。

折算掉含水量為3.88÷（1-0.52）（含水量）=8.08 kg。

因?yàn)閺?qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂的工作交換容量是在給定工作條件下實(shí)際可利用的離子交換能力，一般只有理論上的交換容量約60%。按實(shí)際工作交換容量折算：8.08÷0.6=13.5 kg。

考慮到工作交換容量與實(shí)際運(yùn)行條件的關(guān)系非常大，起始用量采用15 kg。第1次陽離子交換樹脂15 kg處理后，殼低聚糖的灰分為0.72%。可見，15 kg陽離子交換樹脂的真正工作交換能力不到375g，只有約110 kg×（0.92%-0.72%）=220 g，要去除375 g的灰分，估計(jì)需陽離子交換樹脂為375 g÷220 g×15 kg=25.6 kg。因此分別采用以每次遞加5 kg的量，即20 kg和25 kg的強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂用量繼續(xù)考察對纖維素酶去除灰分的作用，強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂分別為0，15，20，25 kg。

2.5 強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂的再生[14]

經(jīng)靜態(tài)交換的強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂，經(jīng)甩干，水洗，再甩干的步驟，再加濃鹽酸（HCl），攪勻，調(diào)pH=1，放置，再生，待用。結(jié)果見表2。

表2 纖維素酶與強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂用量比例變化

3 討論

強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂可交換所有的陽離子，因纖維素酶中的灰分主要是氯化鈉鹽，故采用型號為“Na+”強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子樹脂進(jìn)行陽離子交換：R-H（陽離子交換樹脂）+M-Cl（酶）→R-M+HCl，其交換產(chǎn)生的HCl又可作為殼聚糖酶解時(shí)用的鹽酸，故不需要對Cl-進(jìn)行陰離子交換去除。本研究中的創(chuàng)新點(diǎn)正是只需進(jìn)行1次陽離子交換，無須進(jìn)行陰離子交換去除陰離子，操作步驟簡便，就可達(dá)到降低纖維素酶的灰分，進(jìn)而降低殼低聚糖灰分的目的。

灰分是產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵控制點(diǎn)。由表2可見，殼低聚糖的灰分降低效果明顯。纖維素酶用量5 kg不變的情況下，隨著陽離子交換樹脂用量的增加，能交換去除纖維素酶中陽離子的量也相應(yīng)增加，即能去除的灰分就增加，灰分降低。當(dāng)纖維素酶用量-陽離子交換樹脂用量（kg）的比例為5∶25（即1∶5）時(shí)，纖維素酶中的灰分已基本去除，殼低聚糖中的灰分達(dá)到產(chǎn)品的質(zhì)量要求，不僅提升了產(chǎn)品質(zhì)量，也大大降低了產(chǎn)品因灰分不合格而報(bào)廢的風(fēng)險(xiǎn)，提高了效益。該方法具有交換容量大、產(chǎn)業(yè)化放大容易、樹脂可長期反復(fù)使用的特點(diǎn)，操作工序簡便易行、生產(chǎn)成本低，可廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，為殼低聚糖的生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用在質(zhì)量上提供了有力保障，也能產(chǎn)生良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

鑒于殼聚糖原料中也存在一定的灰分，是否結(jié)合去除殼聚糖中的灰分，進(jìn)一步提升殼低聚糖的質(zhì)量，還值得今后進(jìn)一步探討[15-16]。