熒光定量PCR在腦脊液結核分枝桿菌DNA檢測中的應用價值分析

劉冬宇 郝艷霞

【摘要】

目的：對熒光定量PCR在腦脊液結核分枝桿菌DNA檢測中的應用價值展開分析與探討。方法：選擇在我院接受檢查的結核性腦膜炎患者91例和非結核性腦膜炎患者42例納入本次研究，分別利用熒光定量PCR和改良羅氏培養法對研究對象的腦脊液樣本進行檢測，比較兩種檢測方法的檢測結果。結果：熒光定量PCR和改良羅氏培養法對結核性腦膜炎患者腦脊液中結核分枝桿菌的檢驗陽性率分別為60.44%、16.48%，相較于改良羅氏培養法，熒光定量PCR對結核性腦膜炎患者腦脊液中結核分枝桿菌的陽性率更高（P<0.05）。結論：熒光定量PCR在腦脊液結核分枝桿菌DNA檢測中的應用價值較高，可考慮將其廣泛應用至臨床對結核性腦膜炎的診斷當中。

【關鍵詞】熒光定量PCR;腦脊液;結核分枝桿菌DNA;應用價值

【中圖分類號】R4

【文獻標識碼】A

【文章編號】2095-6851（2020）04-143-01

結核性腦膜炎很容易被錯誤的診斷為化膿性腦膜炎、病毒性腦炎和腦腫瘤等疾病，且該疾病的病情發展速度較快、預后一般不佳，因此，尋找出一種可快速在早期明確診斷結核性腦膜炎的方法十分必要[1]。本研究旨在對熒光定量PCR在腦脊液結核分枝桿菌DNA檢測中的應用價值展開分析與探討，研究詳情如下。

1研究對象及方法

1.1研究對象

選擇在我院接受檢查的結核性腦膜炎患者91例和非結核性腦膜炎患者42例納入本次研究，研究對象選取時間范圍為2017年2月至2019年4月，91例結核性腦膜炎患者中62例為男性、29例為女性，年齡最大的75歲，年齡最小的3個月，年齡均數（39.07±16.35）歲;42例非結核性腦膜炎患者中27例男性、15例女性，年齡最大的74歲，年齡最小的5個月，年齡均數（38.54±15.83）歲，統計學分析結果顯示兩組研究對象基本情況未見有明顯差別，臨床表現可見為均衡性（P>0.05）。

1.2方法

1.2.1儀器和試劑

本研究分別對產自湖南圣湘生物科技有限公司的熒光定量PCR檢測試劑、德國QIAGEN公司的Rotor-Gene Q熒光定量PCR儀和依據國際防癆和肺病聯合會推薦配方自行配置的改良羅氏培養基進行了應用。

1.2.2熒光定量PCR

利用震蕩方法將500uL腦脊液和200uL濃縮液混勻，并進行每分鐘8000r持續3分鐘的離心，吸除上清液后加入無菌生理鹽水1ml重懸沉淀，再進行每分鐘8000r持續3分鐘的離心，吸除上清液后留沉渣備用。于沉渣中加入核酸釋放劑50ul，反復吸打混勻后靜置2-3分鐘。把38uLPCR反應液、1uL內標、2uL酶結合物和5uL制備好的樣本加入PCR反應管中，經45個15秒94℃、30秒57℃循環后進行10秒25℃延伸，以使之得到充分反應。若Ct值超過39的樣本同時顯示為內標陽性則認定為陰性;若Ct值不足39且曲線呈現標準的S形則認定為陽性。

1.2.3改良羅氏培養法

在2ml腦脊液中加入2倍量35g/L氫氧化鈉處理液，充分震蕩并放置于37℃的水浴箱中15分鐘，期間進行2次震蕩后對標本進行每分鐘3000r持續10分鐘的離心，將上清液吸去保留沉淀物。于羅氏培養基中接種0.1ml沉淀物并將其置入36℃孵育箱，分別于第3、7、14、21、28、35、42、49、56天進行觀察，若經涂片抗酸染色確認有菌落生長則為陽性，無菌落生長視為陰性。

1.3評估依據

比較熒光定量PCR和改良羅氏培養法對結核性腦膜炎患者及非結核性腦膜炎患者腦脊液的檢測結果。

1.4統計分析

使用X2檢驗計數資料，若結果為P<0.05，則代表數據間差異統計學意義明顯，所有數據的統計皆經由SPSS19.0軟件完成。

2結果

下表1顯示，熒光定量PCR和改良羅氏培養法對結核性腦膜炎患者腦脊液中結核分枝桿菌的檢驗陽性率分別為60.44%、16.48%，相較于改良羅氏培養法，熒光定量PCR對結核性腦膜炎患者腦脊液中結合分枝桿菌的陽性率更高（P<0.05）。熒光定量PCR和改良羅氏培養法對非結核性腦膜炎患者腦脊液中結核分枝桿菌的檢驗結果皆呈陰性（P>0.05）。

3討論

在所有結核病當中，結核性腦膜炎是嚴重程度最高的一種肺外結核病型，有統計結果顯示，三成左右的結核性腦膜炎患者會在接受抗結核治療后死亡，特別是兒童，對結核性腦膜炎進行早期確診和及時治療是對患者疾病預后進行改善的一項重要手段[2]。

MTB培養法是臨床對結核病進行診斷的金標準，具有特異性高、精準、可靠的特點，但一般需對檢驗標本進行4-8周的培養才能獲得結果，且僅活菌才能被培養出來，使結核病患者難以在疾病早期得到準確診斷，耽誤其及時接受對癥治療[3]。為尋找出一種更為理想的結核菌檢測方法，本研究分別對91例結核性腦膜炎患者與42肺結核性腦膜炎患者的腦脊液進行了熒光定量PCR和改良羅氏培養法，所得結果顯示：熒光定量PCR對結核性腦膜炎患者腦脊液中結核分枝桿菌的檢驗陽性率為60.44%，明顯高于改良羅氏培養法的16.48%，在很大程度上證明了熒光定量PCR在檢測腦脊液結核分枝桿菌中的臨床價值。

可見，熒光定量PCR在腦脊液結核分枝桿菌DNA檢測中的應用價值較高，可考慮將其廣泛應用至臨床對結核性腦膜炎的診斷當中。

參考文獻：

[1]吳利，葛章文，廖萍.熒光定量PCR檢測技術在結核診斷中的應用探討[J].臨床醫藥文獻電子雜志，2019，6（8）：155-156.

[2]譚珂，孫炳奇.熒光定量PCR檢測技術在結核診斷中的應用探討[J].中國醫療器械信息，2018，24（4）：7-8.

[3]王俊妨，靳穎，牛偉霞， 等.熒光定量PCR在腦脊液結核分枝桿菌DNA檢測中的應用[J].檢驗醫學，2017，32（2）：135-137.