遼寧絨山羊絨肉兼用品系ZBED6基因克隆、分子特征分析

趙艷嬌 李豐田 張曉鷹 郭丹 白文林

摘 要 本研究以遼寧絨山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆ZBED6基因進(jìn)行序列測(cè)定，分析基因的5′調(diào)控區(qū)、編碼區(qū)。借助生物信息學(xué)分析軟件，將遼寧絨山羊ZBED6基因與其他物種基因序列進(jìn)行比對(duì)，并預(yù)測(cè)其CpG島，為遼寧絨山羊的分子育種研究奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ZBED6基因；克隆；遼寧絨山羊

遼寧絨山羊原產(chǎn)于遼寧省東南部山區(qū)是我國(guó)絨山羊品種中產(chǎn)絨量最高的優(yōu)良品種，屬絨肉兼用型品種。遼寧省畜牧科學(xué)研究院新培育的遼寧絨山羊“絨肉兼用”新品系種羊具有體格高大，遺傳性能穩(wěn)定，生長(zhǎng)速度快等優(yōu)勢(shì)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)參與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程基因的研究也越來(lái)越深入。鋅指蛋白（ZBED）是IGF2基因的內(nèi)含子3突變區(qū)域中存在的一個(gè)抑制因子，大量研究表明，ZBED作為轉(zhuǎn)錄因子在哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育甚至是細(xì)胞的增殖分化的過(guò)程中有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。本文從分子生物學(xué)的角度闡述了ZBED6對(duì)遼寧絨山羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)，為遼寧絨山羊“絨肉兼用”品系分子育種工作提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均來(lái)自于遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心畜牧業(yè)部的健康遼寧絨山羊，選取成年公羊13只。

1.2 試驗(yàn)藥品

DEPC、DNA聚合酶、MgCl2（25mM）、10×TAE、6×DNA Loading Buffer、引物等均采自上海生工生物有限公司；DM2000 Marker、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑、TaqDNA聚合酶、dNTP Mixture、總RNA提取試劑盒采自大連TaKaRa生物有限公司；氯仿、無(wú)乙水醇、異丙醇1、丙三醇等采自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；去離子水為實(shí)驗(yàn)室提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 總RNA的提取

對(duì)遼寧絨山羊的七種不同組織的總RNA的提取，采用TRIzol法對(duì)總RNA進(jìn)行提取，提取后的RNA的濃度和純度使用Thermo Scientific核酸測(cè)定儀和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 總RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

用PrimeScrimeTM RT Reagent Kit（TaKaRa，大連）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，，第一步先去除樣品中殘留的基因組RNA反應(yīng)，完成后將離心管取出，繼續(xù)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，PCR儀設(shè)置成：37℃，15min；85℃，5s；4℃。將配制好的共40μl的反應(yīng)液，充分混勻后放置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完成后將合成的cDNA于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PCR反應(yīng)

設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)遼寧絨山羊的IGF2基因5′調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的cDNA，建立25μlPCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行測(cè)序。

3 結(jié)果與分析

3.1 ZBED6突變位點(diǎn)及位置

經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，通過(guò)特異性設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出遼寧絨山羊的ZBED6基因序列長(zhǎng)度為4851bp，包括5′調(diào)控區(qū)、編碼區(qū)，編碼區(qū)長(zhǎng)度為2943bp。將克隆出的遼寧絨山羊序列與山羊的序列進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，第838bp處發(fā)生A/G突變；第944bp處發(fā)生A/G突變；第1799bp處發(fā)生C/T突變；2276bp處發(fā)生A/G突變；2323bp處發(fā)生C/T突變；2333bp處發(fā)生G/T突變；2397bp處發(fā)生A/G突變；2480bp處發(fā)生A/G突變。

3.2 不同物種的ZBED6基因分子進(jìn)化關(guān)系

將克隆出的遼寧絨山羊的ZBED6序列與其他動(dòng)物的ZBED6序列進(jìn)行對(duì)比分析，遼寧絨山羊與和山羊的同源性高達(dá)99.8%，與其它物種相比，ZBED6的同源性分別是：綿羊99%，藏羚羊99%，牦牛98%，水牛98%，豬91%，馬90%。通過(guò)以上動(dòng)物之間的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ZBED6作為調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的基因在部分偶蹄目動(dòng)物和奇蹄目動(dòng)物中不僅是在物種內(nèi)高度保守，在種間也同樣高度保守，在進(jìn)化過(guò)程中趨于穩(wěn)定。

3.3 ZBED6蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)特征

對(duì)遼寧絨山羊ZBED6編碼區(qū)總長(zhǎng)度進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的分析，遵循Kozak法則（起始密碼子為ATG結(jié)構(gòu)），通過(guò)軟件分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)軟件預(yù)測(cè)，其體外半衰期為30小時(shí)，不穩(wěn)定系數(shù)為50.72（該值大于40為不穩(wěn)定蛋白），脂肪族氨基酸指數(shù)為83.06，其蛋白質(zhì)氨基酸殘基親疏水性總和為-0.281，說(shuō)明遼寧絨山羊ZBED6的編碼蛋白質(zhì)疏水性較弱且不穩(wěn)定。

4 討論

ZBED6作為一種調(diào)控基因其特點(diǎn)主要是IGF2的抑制因子，通過(guò)生物學(xué)信息分析發(fā)現(xiàn)，其mRNA有較高的化學(xué)能，作為一種抑制因子，該特點(diǎn)使基因有較高的穩(wěn)定性，通過(guò)保守區(qū)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其具有較高的保守性。隨著基因的分子進(jìn)化，構(gòu)成蛋白質(zhì)序列的所有氨基酸的種類(lèi)并不是共同進(jìn)化的，一些重要的氨基酸序列依然是具有非常高的保守性，這就導(dǎo)致了在蛋白質(zhì)家族成員中有一些相同的核心的保守區(qū)，所以可以通過(guò)對(duì)保守區(qū)的對(duì)比，推測(cè)某種未知蛋白的潛在功能。

5 小結(jié)

（1）遼寧絨山羊ZBED6的基因編碼區(qū)，發(fā)現(xiàn)ZBED6基因編碼區(qū)序列總長(zhǎng)度為2943bp，編碼980個(gè)氨基酸。克隆出的序列中，第838bp處發(fā)生A/G突變；第944bp處發(fā)生A/G突變；第1799bp處發(fā)生C/T突變；2276bp處發(fā)生A/G突變；2323bp處發(fā)生C/C突變；2333bp處發(fā)生G/G突變；2397bp處發(fā)生A/A突變；2480bp處發(fā)生A/G突變。（2）通過(guò)不同物種之間的親緣關(guān)系進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)ZBED6基因在物種之間是比較保守的，不同目之間的也有80%以上的相似度。（3）對(duì)ZBED6的啟動(dòng)子序列和CpG島進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)ZBED6有三個(gè)TATA-box，四個(gè)CpG島，并對(duì)預(yù)測(cè)其mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)性質(zhì)。（4）利用軟件對(duì)ZBED6的信號(hào)肽和蛋白質(zhì)親水性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ZBED6沒(méi)有信號(hào)肽序列，兩者均是親水性蛋白質(zhì)。（5）ZBED6編碼980個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量是109518.38，對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其固定的結(jié)構(gòu)域具有高度保守的特點(diǎn)，并預(yù)測(cè)其三維結(jié)構(gòu)。

參考文獻(xiàn)

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[2]孫亞波等. 遼寧絨山羊羔羊肉用性能和羊肉品質(zhì)研究[ J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2014.（09）：14-18.

作者簡(jiǎn)介：趙艷嬌（1979-），女，漢族，碩士，高級(jí)畜牧師，研究方向：絨山羊育種管理。

通訊作者簡(jiǎn)介：郭丹（1981-），女，漢族，碩士，研究員級(jí)高級(jí)畜牧師，研究方向：絨山羊育種。

基金項(xiàng)目：國(guó)家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系飼料資源開(kāi)發(fā)崗位（CARS-39-10）、農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2017202005）