miRNA表達水平對缺血性腦卒中作用機制的研究進展

張欽政 鄭洋洋 李琪 陳宏娟 閆本純 馬潤瑤 張晗 閆海潤

[摘要] 缺血性腦卒中（IS）發病率具有增高的趨勢，目前缺乏診斷IS敏感的特異性生物學標志物。miRNA因其組織特異性強、易于放大信號通路、平均半衰期較長、能夠反復凍融等優點，故其作為生物標志物已成為診斷IS的研究熱點。本文綜述了在IS中對細胞具有保護與損傷作用的miRNA及其作用機制，并且討論了對于IS具有潛在診斷價值的miRNA，以及有助于確定IS分期的miRNA，以期為IS的研究、臨床診斷及治療提供新思路、新靶點。

[關鍵詞] miRNA;缺血性腦卒中;生物標志物;分子機制

[中圖分類號] R743.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）02-0189-04

Research progress on action mechanism of miRNA expression levels on ischemic stroke

ZHANG Qinzheng1? ZHENG Yangyang1? ?LI Qi1? ?CHEN Hongjuan1? ?YAN Benchun2? ?MA Runyao1? ?ZHANG Han1? YAN Hairun1

1.Department of Laboratory， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang? ?157011， China; 2.Department of Urinary Surgery， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang? ?157011， China

[Abstract] The incidence of ischemic stroke （IS） is increasing， but currently there is no sensitive specific biomarkers for the diagnosis of IS. MiRNAs have become a research hotspot in the diagnosis of IS because of their strong tissue specificity， easy amplification of signal pathways， long average half-life， and ability of repeated freezing and thawing. This article reviews the miRNAs that protect and damage cells in IS and their mechanism of action， discusses the miRNAs with potential diagnostic value for IS as well as the miRNAs that help determine the IS stage in order to provide new ideas and new targets for the study， clinical diagnosis and treatment of IS.

[Key words] MiRNA; Ischemic stroke; Biomarker; Molecular mechanism

腦卒中（Stroke）又稱中風，已成為世界范圍的第二死亡疾病和第三致殘疾病[1]。其中，缺血性腦卒中（Ischemic stroke，IS）約占其80%。臨床上，診斷IS主要依賴于臨床癥狀表現和影像學檢查。目前尚無準確診斷急性缺血性腦卒中（Acute ischemic stroke，AIS）的生物標志物。因此，從分子生物學角度對IS的發病機制進行深入研究，積極探索有效的生物標志物具有重大的臨床價值。

miRNA（micro RNA）是一類由20～25個核苷酸組成的內源性非編碼單鏈小RNA分子，通過完全或不完全堿基互補配對原則與特定靶基因信使RNA（mRNA）的3-非翻譯區（3-UTR）或5-UTR，抑制mRNA翻譯或直接降解其特定mRNA，在基因轉錄調控和生物體正常發育中發揮重要作用。miRNA作為蛋白表達過程中的調節物質，可較早反映IS患者的生理病理變化。據研究報道，miRNA是神經細胞生長的調節因子，并參與神經功能調節。部分miRNA對于IS患者或小鼠的神經細胞等存在保護或損傷作用，探索其保護或損傷作用機制對于IS診斷和評估預后具有重要意義，甚至可以根據不同機制而確定不同治療靶點，為IS的治療提供新方向。

1 miRNA參與細胞保護作用

1.1 通過調控靶基因Caspase 3

Ni J等[2]研究發現，在IS患者和實驗動物的血漿及大腦中，miR-let-7c-5p的含量顯著降低。Caspase 3是受miR-let-7c-5p調控的靶基因，誘導miR-let-7c-5p過度表達通過抑制中風后小膠質細胞激活以保護大腦免受缺血損傷，這一過程可能是通過參與Caspase 3表達調控機制實現的。誘導miR-let-7c-5p過度表達可能是治療IS的一個新方法，值得進一步探討。miR-let-7c-5p是miRNA let-7c家族成員。但有研究表明，miRNA let-7c可促進ox-LDL誘導的人內皮細胞凋亡，提示miRNA let-7c具有促進動脈硬化作用[3]。

1.2 通過調控腦血管內皮細胞整合素αvβ3

梁國安等[4]研究發現，缺血缺氧性腦損傷可誘導miR-210表達上調，促進腦組織血管內皮生長因子（VEGF）表達和血管再生，從而發揮內源性腦保護機制。Zhang H等[5]研究表明，以RGD-exo作為靶向載體，通過NIRF成像和免疫熒光證實RGD-exo：miR-210的靶向性，短暫大腦中動脈閉塞（MCAO）小鼠模型靜脈給藥后，RGD-exo：miR-210與缺血區反應性腦血管內皮細胞整合素αvβ3 結合，致使缺血部位miR-210增加，從而減弱中風癥狀。關于miR-210的機制尚不完全明確，仍存在爭議。Huang L等[6]研究認為，miR-210的抑制顯著降低TNF-α，IL-1β，IL-6，CCL2和CCL3的表達，而對TGF-β和IL-10沒有顯著影響，因此可以抑制IS急性期的促炎反應和減少腦損傷。已報道miR-210有20多種直接靶標，而miR-210對IS調節的最終結果可能取決于多種靶基因作用的平衡和整合。

1.3 通過調控炎性因子TNF-α、IL-1β及AKT和ERK信號通路

脂肪干細胞（ADSCs）療法是治療中風有前景的方法，ADSCs是外泌體的重要來源，且外泌體中多為miRNA。Geng W等[7]首次證實miR-126在AIS患者血漿和缺血后大鼠血漿以及腦組織中下調。為了明確miR-126的作用，通過過表達或敲低技術來上調或下調ADSCs中miR-126的表達，從而分別獲得miR-126+和miR-126-。ADSCs衍生外泌體可導致神經細胞死亡減低和細胞增殖，miR-126+進一步增強這一結果，而miR-126-則相反。通過免疫熒光分析Bv2細胞的活化，揭示miR-126+ 在治療MCAO大鼠中的潛在功能。相比miR-126-，miR-126+更能抑制Bv2細胞活化。采用ELISA法監測腦組織中TNF-α和IL-1β表達，顯示miR-126+相比miR-126-更顯著抑制TNF-α和IL-1β產生，表明miR-126在MCAO大鼠外源性調節的神經炎癥中起重要作用。為進一步驗證miR-126+對TNF-α和IL-1β分泌的影響，研究者構建了氧和葡萄糖剝奪（OGD）模型，miR-126+和miR-126-處理Bv2細胞，結果與上述相同。Pan Q等[8]研究發現，miR-126在內皮細胞（ECs）和內皮祖細胞（EPCs）中高表達，增強細胞增殖和遷移，保證血管完整。

Luo Q等[9]研究表明，來自ADSCs的miR-126過表達在緩解急性心肌缺血性損傷中具有治療意義。Qu M等[10]研究發現，miR-126可通過抑制其靶標酪氨酸磷酸酶非受體9型（PTPN9）以及激活AKT和ERK信號通路減少腦萎縮體積并改善缺血小鼠神經功能。miR-126具有兩條鏈：miR-126-3p和miR-126-5p，兩者過表達均促進人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）增殖、缺血性小鼠腦血管生成及神經生長，并進一步改善神經功能。Zheng T等[11]研究發現，miR-130a可通過PTEN/PI3K/AKT途徑對IS發揮神經保護作用。

1.4 通過調控MAPK途徑

研究表明，MAPK信號傳導可影響血腦屏障（BBB）的完整性[12]，增強IS后神經細胞炎癥小體活化，對神經細胞增殖、適應和分化具有重要作用，對于腦缺血期間炎癥和細胞凋亡的調節至關重要。盡管有許多關于miR-145和MAPK途徑在腦血管疾病或中風中的作用研究，但尚未研究在IS中miR-145與MAPK信號傳導途徑之間的關聯。Xue WS等[13]研究，通過靶向MAPK途徑治療IS，探索miR-145在神經干細胞（NSCs）功能中的作用。miR-145的過表達促進了NSCs中MAPK通路的相關mRNA和蛋白的表達，而miR-145的表達下調抑制了MAPK通路。miR-145在NSCs中的過表達促進了G1/S-特異性周期蛋白-D1（Cyclin D1）、巢蛋白（Nestin）、神經元特異性烯醇化酶（NSE）和膠質纖維酸性蛋白（GFAP）蛋白上調，增強了NSCs活性，促進細胞增殖和分化，同時抑制Cleaved-caspase 3表達和細胞凋亡。miR-145通過靶向MAPK途徑在大鼠IS治療中保護NSCs的功能，對IS治療進展具有重要意義。侯麗淳等[14-15]預測miR-145為編碼CD40的靶基因，miR-145在IS患者血清中表達水平上調，其過表達將抑制CD40基因表達從而減少血管內炎癥因子釋放。Dong H等[16]研究發現，miR-22也可通過MAPK途徑減輕IS大鼠炎癥。

1.5 通過調控AMPK活性

AMP依賴蛋白激酶（AMPK）在IS中的作用仍然存在爭議，對于神經元新生可能具有雙重作用。Wang Z等[17]研究認為，miR-27b直接靶向AMPK，影響其表達。在小鼠模型中，miR-27b抑制劑（miR-27b antagomir）顯著增強行為功能恢復和空間記憶能力，并通過調節AMPK活性促進IS恢復。

2 miRNA參與細胞損傷作用

2.1 通過調控Bcl-2和Bcl-w

Yin KJ等[18]研究表明，miR-497是一種促凋亡調節因子，在缺血性神經細胞死亡調控中起關鍵作用。在Bcl-2和Bcl-w的3-UTR上有miR-497的結合位點，miR-497過表達通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-w促進缺血性神經細胞死亡。Chen X等[19]研究發現miR-497通過抑制Bcl-2和微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3（LC3）加劇梗死面積和神經功能損傷，且LC3在神經元自噬過程中至關重要。miR-497激動劑（miR-497 agomir）僅抑制線粒體靶向Bcl-2表達，而不是ER靶向的Bcl-2。在大腦缺血發生后，miR-497明顯增加，對神經細胞死亡調控具有關鍵作用。

另有研究認為[20]，在IS小鼠模型中，miR-15a/16-1表達增加，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-w，促進炎癥反應加重腦損傷。小鼠尾靜脈注射miR-15a/16-1 antagomir抑制miR-15a/16-1活性，顯著降低IL-6、MCP-1、VCAM-1、TNF-α的表達，增加Bcl-2和Bcl-w的表達，從而減小腦梗死體積，并改善IS小鼠神經功能。之前研究發現，OGD誘導的miR-15a表達上調可升高小鼠腦血管內皮細胞（CEC）。在體外，miR-15a功能喪失可導致Caspase-3活性增強，高爾基體片段減少。提示miR-15a的高表達抑制Bcl-2，并在OGD誘導的CEC凋亡中起負作用。

2.2 通過調控Nrf2和HO-1表達

Ma Q等[21]采用實時PCR技術檢測在發病6 h內AIS患者血漿和中性粒細胞中的miR-93水平降低，在體外治療中miR-93 agomir通過誘導Bv2細胞周期G1期停滯抑制OGD誘導的Bv2細胞增殖。Wang P等[22]研究認為，miR-93可直接結合在核因子紅細胞相關因子2（Nrf2）的3-UTR靶點，然后減弱Nrf2和血紅素加氧酶-1（HO-1）表達。Nrf2/HO-1通路是一種重要防御機制，可抵抗缺血/再灌注后有誘導的氧化應激反應，從而miR-93可加重腦缺血損傷。

2.3 通過調控靶基因Mcl-1

miR-106b-5p對IS神經功能影響等具有負相關關系。Li P等[23]認為miR-106b-5p上調是腦缺血損傷的重要原因，繼續探索了miR-106b-5p中風的分子機制，在MCAO大鼠腦內Bax表達上調，Bcl-2表達下調。采用熒光素酶報告基因實驗測定證明Mcl-1是miR-106b-5p的靶基因，Mcl-1是Bcl-2家族的抗凋亡成員。miR-106b-5p antagomir顯著降低丙二醛（MDA），恢復超氧化物歧化酶（SOD）活性，增加Mcl-1表達，并減少Bax表達，從而減少梗死體積，降低神經細胞損傷，改善神經功能。miR-106b-5p antagomir的研究對于未來治療IS具有臨床意義。

3 展望

miRNA具有組織特異性強，信號通路易放大，平均半衰期較長，可反復凍融等優點，已成為多種疾病的新型生物標志物。但尚無miRNA作為IS診斷標志物應用于臨床，需進一步研究。Ma Q等[21]評估miR-93在IS發病后6 h內診斷和預測潛力，發現血漿和中性粒細胞中的miR-93是診斷AIS潛在生物標志物，首次為miR-93在AIS中的診斷價值提供證據，且中性粒細胞中的miR-93水平為AIS患者潛在預后生物標志物。李東斌等[24]研究顯示，血漿外泌體源性miR-422a對于IS早期（發病1-3d）具有極高的診斷價值。Li DB等[25]研究認為，聯合檢測miR-422a和miR-125b-2-3p表達水平有利于確定IS的進展階段。

近年來，對于IS的研究進展已取得較大進步，IS發生后短時間內可以在體液中檢測到miRNA表達水平上調或下調，檢測其表達水平變化對神經細胞及功能的影響，有助于對IS進行診斷和預后監測。但目前部分miRNA對于IS的發病意義還存在爭議，這可能與發病機制不同、檢測樣本量小等原因有關，需要進一步研究。隨著對miRNA研究的深入，檢測miRNA對IS的分期、分類具有指導作用，對于早期干預IS進展也具有重要臨床價值，且有望成為IS早期診斷和評估預后的新型標志物和治療新靶點，發展前景廣闊。

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（收稿日期：2019-07-17）