基于SNP芯片研究PI3K/Akt/mTOR通路上自噬相關基因SNPs與胃癌的關聯

舒智雄，吳傳城，吳曉麗，劉寶英*

(福建醫科大學公共衛生學院，福建 福州350122)

胃癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，居消化系統腫瘤的首位[1]，是我國農村地區上消化道腫瘤死亡首要原因[2]，福建省仙游縣更是我國惡性腫瘤尤其是胃癌的高發區[3]。大量研究表明自噬功能紊亂會導致腫瘤發生、影響腫瘤進展及預后[4]，近年來細胞自噬與胃癌的關系引起廣泛關注[5]。自噬的激活涉及眾多信號通路，其中磷脂酰肌醇3-激酶、絲蘇氨酸激酶和雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine kinase/mechanistic target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)等信號通路在自噬體的形成和成熟過程中發揮著關鍵性的作用[6]，抑制其信號傳導可使自噬水平提高進而抑制腫瘤細胞的增殖[7]。PI3K/Akt/mTOR 通路上基因單核苷酸多態性位點(single nucleotide polymorphisms，SNPs)的存在可能導致其信號傳遞受阻，從而參與腫瘤的發生發展[8]，但目前尚未見系統性分析該通路上與自噬相關的基因單核苷酸多態性與胃癌的關聯性的研究報道。因此，本研究采用SNP芯片聯合生物信息學篩檢仙游縣胃癌患者血液中與對照人群間差異的PI3K/Akt/mTOR 通路上相關基因SNPs，采用病例-對照研究分析篩選出來的SNPs與胃癌易感性的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用1∶1 配對的病例-對照研究，胃癌病例來源于福建省仙游縣醫院的胃癌新發病例。大樣本納入標準為：經手術或內窺鏡取得組織標本，經病理確診的新發病例；確診日期為2013 年4 月—2017 年3 月；在仙游本地居住10年以上。芯片組納入標準是在此基礎上選擇男性，年齡50～70 歲，經病理確診為胃腺癌的患者。排除標準：經病理確診為胃部炎癥、良性病變及病情危重或不能清晰回答問題者及腫瘤繼發病例和復發病例。

健康對照納入標準：按性別、年齡、地區與病例進行配對，其中芯片健康對照選擇年齡±3歲與病例進行配對，大樣本健康對照選擇年齡±5歲與病例進行配對。選在仙游本地居住10年以上。排除標準為：胃癌或慢性萎縮性胃炎的直系家屬。

以上標本均要求資料和血樣完整，最后SNP芯片檢測階段我們納入病例和對照各96例，均為男性，年齡分布在52～71 歲。其中病例組平均年齡(63.8±4.6)歲，對照組平均年齡(63.8±4.7)歲。

在驗證階段納入確診胃癌病例622 例，正常對照622 例，其中男性466 對，女性156 對。病例組由312例賁門癌患者和310 例非賁門癌患者組成。病例組年齡分布在39～89 歲，平均年齡為(67.3±9.7)歲；對照組年齡分布在41～87 歲，平均年齡為(67.2±9.7)歲。經均衡性檢驗，病例組與對照組在年齡、性別、職業等方面差異均無統計學意義(P＞0.05)。文化程度和婚姻狀況差異有統計學意義(P＜0.05)。病例組中高中及以上的文化程度比例低于對照組，已婚的婚姻狀況比例高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

1.2 資料收集

采用統一設計的調查表，進行面對面的訪談式調查，內容包括研究對象的年齡、性別、文化程度、婚姻狀況、職業史等相關因素，病例的病史資料經患者本人及醫院同意后通過摘錄電子病例獲得。同時采集病例及對照人群的空腹外周靜脈血5 mL，抽取的血樣置于EDTA抗凝管，3 000 r/min離心10 min后，分裝成血漿、白細胞、紅細胞，置-80 ℃低溫冰箱保存。本研究涉及的調查數據及人體數據，均已通過福建醫科大學生物醫學研究倫理委員會的審查，符合醫學倫理相關規定和要求。

1.3 基因分型原理與位點的篩選

1.3.1 芯片基因分型原理利用Affymetrix 生產的920K Axiom Precision Medicine Research Array 對病例和對照的外周血白細胞中的總DNA進行單核苷酸多態性基因型檢測。基因芯片分型技術采用酶介導及單堿基測序的全自動化流程，共包含可檢測的位點92萬余個，其中80 多萬個SNPs 及臨床相關變異位點經過GWAS 研究分析，對主要的祖先群體具有最佳的基因組覆蓋率。

1.3.2 PI3K/Akt/mTOR通路上相關基因SNPs的篩選方法通過KEGG pathway 網站和Gene Ontology 數據庫 匯 總 PI3K/Akt/mTOR、 Autophagy 通 路(Homo sapiens) 上所有基因， 利用Ensemble 數據庫和HaploView 軟件查找二者交集基因SNPs，并與芯片中的取交集，得到芯片中PI3K/Akt/mTOR 通路上與自噬有關基因SNPs，利用SPSS和Excel 軟件通過卡方檢驗篩選出以上SNPs 在病例組和對照組中表達有差異(P＜0.05)的位點。同時將以上具有統計學意義SNPs所在的基因通過STRING、Cytoscape 軟件做蛋白互作網絡(protein protein interaction network，PPI network)分析基因編碼蛋白間的相互作用，篩選關鍵節點基因。根據1000 Genomes Browser (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)查找以上關鍵節點基因SNPs 在中國南方漢族人群中的最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)，選擇MAF 在0.15～0.4的位點，篩選功能預測有相應功能的SNPs，對各多態性位點進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡度(H-W 平衡)檢驗，選取基因型頻率分布在健康對照人群中符合H-W平衡(P＞0.05)的位點作為候選基因位點進行后續實驗分析。過程如圖1。

1.3.3 大樣本人群中基因分型原理與方法在622對病例對照人群樣本中將5個候選SNPs區域的DNA模板通過PCR技術擴增，再使用特異的延伸引物與PCR產物進行單堿基延伸反應。采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDITOF-MS)技術，檢測延伸產物分子質量，應用專用的分析軟件，通過判斷分子大小的差異進行SNP分型檢測。

1.4 PCR擴增引物設計

對5個候選SNPs進行基因型鑒定，使用Sequenom公司Genotyping Tools 及Mass ARRAY Assay Design軟件設計待測SNPs 的PCR 擴增引物及單堿基延伸引物，序列見表1。

表1 5個SNP位點引物序列

1.5 質量控制

按以下標準進行質量控制：①所有病例均經過病理確診；②剔除DNA 總量＜0.6 μg、存在降解、有小片段RNA污染及未能檢測出基因型的樣本；③芯片分型過程中使用評估信號值分布與背景信號值的差異(Dish QC)對樣品進行質控，剔除Dish QC 低于0.82的樣品；④基因型的檢測和判讀采用盲法；⑤芯片檢測與MALDI-TOF-MS技術檢測進行結果一致性的比較。

本次實驗Dish QC 均大于0.82，所有樣品都通過質量檢測。所有樣本選擇2%的SNPs 進行重復檢測，一致性為98.47%。前兩批采用MALDI-TOF-MS 檢測的42個SNPs與芯片中的取交集得到5個位點，比較這5 個位點分型結果，發現兩種方法檢測結果一致性好，且分型失敗率低，說明芯片分型結果可靠，如表2所示。

表2 兩種檢測方法檢測相同SNP的一致性情況

1.6 統計學方法

所有實驗室數據經復查和核對后應用EpiData3.1軟件進行數據錄入并建立數據庫。采用χ2檢驗計算對照組的各基因多態性位點分布是否符合H-W平衡，并進行一般人口學資料的均衡性及兩組間的SNPs的表達是否有差異的檢驗；采用Cox Regression 命令擬合條件Logistic模型對單個位點的基因型、等位基因在不同胃癌部位進行單因素Logistic 分析，計算其比值比OR(odds ratio，OR)及95%可信區間(confidential interval，CI)，模型中對相關混在因素進行調整。以上分析均使用SPSS 24.0 軟件包完成。所有P 值基于雙側檢驗，統計學檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 芯片中PI3K/Akt/mTOR 通路基因SNPs 篩選情況

按照上述篩選策略，各步結果如圖1。根據基因編碼蛋白網絡圖顯示至少與4 個蛋白相互作用(圖2)，且Confidence Score＞0.8(表3)篩選得到IRS1、PIK3CD、PIK3R1、AKT1、RPS6KB1、PPP2CA 等 關 鍵 節 點 基因。與胃癌相關的PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相關關鍵節點中滿足MAF 和H-W 標準的共4 個基因5 個SNPs，分別為IRS1 rs10205233、PIK3CD rs3934934、PIK3R1 rs706711、PIK3R1 rs706714、AKT1 rs35285446，詳見表4。

圖1 PI3K/Akt/mTOR通路上自噬相關基因篩選結果圖

圖2 PI3K/Akt/mTOR 通路上與胃癌相關的自噬相關基因編碼蛋白網絡圖

表3 與胃癌相關基因編碼蛋白在STRING數據庫分析相互作用的綜合得分

2.2 PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相關基因SNPs 與胃癌易感性研究

本次選取的5 個SNPs 位點的基因型頻率分布在622例對照組中符合H-W平衡(P＞0.05)。Cox回歸分析結果顯示，在調整了婚姻狀況與文化程度之后，IRS1 rs10205233 的多態性變異(C＞T)顯著降低了胃癌的發病風險[共顯性模型、顯性模型的OR(95%CI)分別為0.761(0.595，0.975)、0.764(0.601，0.973)]，進一步分層分析，該位點顯性模型、隱形模型、共顯性模型以及等位基因在賁門癌和非賁門癌人群中均未見統計學差異(P＞0.05)。此外，尚未發現其余4個位點的共顯性模型、等位基因、顯性模型及隱性模型與胃癌、賁門癌、非賁門胃癌的發病風險存在關聯。結果詳見表5～9。

2.3 PIK3R1單體型分析

我們所研究的PIK3R1基因2個多態性位點的連鎖不平衡分析(圖3)顯示2 位點間具有強連鎖不平衡關系，2位點共可產生4個單體型SNP位點，排列順序依次為rs706711、rs706714，結果單體型1、2、3、4 在病例和對照組的分布差異均無統計學意義(P＞0.05)。表10。

圖3 rs706711與rs706714之間的連鎖關系分析

3 討 論

細胞自噬的生物學功能在許多類型腫瘤中已得到證實，在細胞廢物清除、結構重建、生長發育中起重要作用[9]。自噬的發生是一個復雜的受嚴格調節的細胞內容物的降解和再循環的動態過程，涉及多條信號通路，并由將近40個自噬相關基因編碼的自噬相關蛋白調節[10]。其中PI3K/Akt/mTOR 信號作為一條經典的抗凋亡、促存活通路，其異常激活在腫瘤形成中有著

極其重要作用[11]。Singh 等[12]通過分析PIK3CA、PTEN、mTOR 等分子作用機制，并使用PI3K/Akt/mTOR 通路抑制劑觀察胃癌細胞的惡化狀態，發現胃癌細胞中存在PI3K/Akt/mTOR 信號通路，推斷出使用PI3K/Akt/mTOR 通路抑制劑能改善胃癌細胞惡化狀態。此外，Liu 等[13]研究發現，在胃癌細胞中，PI3K/Akt/mTOR 通路相關蛋白的含量較正常細胞多，并且人體對細胞異變的防衛組織會排斥這種蛋白，這也說明該通路蛋白是導致胃癌發生的一個重要原因。由此可知，PI3K/Akt/mTOR 信號通路可調控胃癌細胞的增殖生長，是使胃部細胞惡化的重要通路。但目前尚未見系統性分析自噬通路相關基因與胃癌關聯性的研究，因此我們采用SNP 芯片較系統地研究PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相關基因SNPs 與胃癌易感性的關聯。

表5 IRS1基因rs10205233位點與胃癌易感性的Cox回歸分析

表8 PIK3R1基因rs706714位點與胃癌易感性的Cox回歸分析

表9 AKT1基因rs35285446位點與胃癌易感性的Cox回歸分析

表10 PIK3R1不同單體型與胃癌遺傳易感性的關系

本研究首先通過KEGG 等數據庫篩選出45 個PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相關基因極其445 558 個標簽SNPs，為了更廣泛地篩選自噬通路新基因SNPs，我們將以上所有標簽SNPs 與SNP 芯片中的位點做交集，發現有1 304 個PI3K/Akt/mTOR 通路上自噬相關基因SNPs位于芯片中。通過卡方檢驗后發現有38 個SNPs 基因分型在胃癌病例和對照中分布差異有統計學意義。但這些位點有些在人群中的變異率很低，有些所對應的基因并不直接受調控因素的影響，而是通過基因間相互作用，間接受調控因素變化影響。因此我們進一步通過生物信息學分析篩選出PI3K/Akt/mTOR 通路上可能與胃癌有關聯的4 個自噬相關的關鍵節點基因(IRS1、PIK3CD、PIK3R1、AKT1)及其5個SNPs，然后對其進行大樣本驗證，最后發現IRS1 rs10205233位點與胃癌的易感性相關，而其他位點與胃癌發病風險無關聯，并且5 個位點均未見文獻報道與腫瘤相關。

在許多癌癥研究中證實，PI3K/Akt/mTOR 信號通路作為聯系胞外信號和胞內應答效應的橋梁分子，可對細胞的生長、増殖、凋亡、遷移等一系列的生理功能產生作用，從而影響癌癥的發生及轉歸。Beclin1蛋白在調節自噬起始囊泡形成的過程中起關鍵作用，Beclin1 是酵母ATG6 在哺乳動物中調節自噬的同源基因，是自噬第一階段不可或缺的基因[14]，而在Beclin1依賴的自噬中，PI3K 活性在自噬體形成中至關重要[15]。PI3K是一類脂質激酶，其主要的生化功能是促使磷酸肌醇的3-羥基基團磷酸化。研究認為，通過酪氨酸激酶受體、細胞黏附分子、G 蛋白偶聯受體等的活化，PI3K 可以催化磷脂肌醇(PI)產生PIP3、PIP4 和PIP5。PIP3 結合并激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB 或Akt)和PDK-1，從而使哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化，進而激活一系列下游信號通路，抑制自噬的發生[16]。mTOR 信號作為調控自噬的一條經典通路，在自噬體的形成和成熟過程中發揮著關鍵性的作用，同時也具有聯系多種自噬調控信號通路的作用，抑制mTOR 信號可使自噬水平提高進而抑制腫瘤細胞的增殖。mTOR 蛋白是一種絲/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，而PI3K/Akt 具有Ser/Thr 激酶的活性，是mTOR 的上游信號。已有大量實驗研究證明[17-18]，PI3K/Akt/mTOR 信號通路可調控許多與細胞代謝、凋亡、增殖和分化有關的蛋白，因此該通路上相關基因單核苷酸多態性的改變可能會影響多種蛋白活性，影響通路的生物學功能，進而影響腫瘤的發生與發展[19]。

我們擴大樣本量后的病例對照研究發現PI3K/Akt/mTOR 信號通路上IRS1 rs10205233 位點(C＞T)多態性變異降低了胃癌的發病風險。而胰島素受體底物1(insulin receptor substrate，IRS1)又是PI3K/Akt/mTOR信號通路的上游信號，Lecker SH 等[20]發現，IRS1/PI3K/AKT1信號通路的啟動取決于IRS1的活性，當細胞外的胰島素信號通過胰島素受體和IRS1傳遞到胞內以后，活化的IRS1 激活PI3K，再使其下游的信號分子AKT1 磷酸化，進而將信號傳遞到mTOR 通路。多項研究表明IRS1 單核苷酸多態性與腫瘤有關[21-22]，如Jung 等[23]的研究發現IRS1 rs1801123、IRS1 rs1801278與年齡等因素的聯合作用顯著增加了患結直腸癌的風險。因此，我們推測IRS1 rs10205233 位點突變后，使IRS1 轉錄翻譯受阻，無法將信號傳遞給PI3K/Akt，進而抑制mTOR的激活，引起細胞周期G1期的延緩或阻滯，誘導胃癌細胞凋亡[24]，并提高自噬水平將癌細胞吞噬降解，從而抑制癌細胞的增殖。

rs10205233 位點可能是新的胃癌患者的遺傳易感標志物，與福建省胃癌高發區仙游縣的胃癌發生發展有關。胃癌的發生發展受到多通路、復雜的級聯調控，節點基因交織在一起，形成復雜的調控網絡，調節著自噬水平，基因突變容易使其喪失對自噬的調控從而導致胃癌的發生。本研究從信號通路入手，通過Affymeytrix Axiom 芯片技術與生物信息學方法，更科學、有效地篩選出符合要求的基因位點，為胃癌的分子機制研究提供基礎資料，為篩查胃癌易感人群和胃癌早期診斷提供基礎數據。但同時也需要更多相關的功能性研究來闡明所發現陽性位點的生物學致病機理以及探索更多未知信號通路，繪制全面的胃癌發生發展的信號通路圖，更深入地了解自噬相關基因變異在胃癌發生發展中的作用機制。