羥胺三氯化鐵法測定人血清膽堿酯酶方法的優(yōu)化

徐海明，郝艷星，陳婭楠，楊惠芳，李江平，朱玲勤，任彬彬，德小明

(寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，寧夏 銀川 750004)

人體內(nèi)的膽堿酯酶(cholinesterase，ChEs)按照水解底物的差異可分為乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)和丁酰膽堿酯酶(butyrocholinesterase，BChE)。50 年代初期，AChE 就用來評價有機(jī)磷農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥中毒情況。有越來越多的證據(jù)表明，人體內(nèi)的ChEs 發(fā)揮著越來越多的生理學(xué)功能[1-2]。具體來說，AChE 與細(xì)胞黏附、增殖、凋亡等生理活動密切相關(guān)[3-4]；BChE 既與解毒存在密切關(guān)聯(lián)，同時被應(yīng)用到惡性腫瘤預(yù)后分析及臨床疾病診斷等領(lǐng)域[5-8]。

定量檢測ChEs 的方法有很多，主要包括改良Ellman法、丁酰硫代膽堿/六氰高鐵酸鉀(Ш)法(由德國臨床化學(xué)協(xié)會推薦，簡稱DGK 法)、P-羥基苯甲酰膽堿偶聯(lián)對羥基苯甲酸-3-單加氧酶法(日本臨床化學(xué)協(xié)會推薦，簡稱JSCC 法)、羥胺三氯化鐵法(標(biāo)準(zhǔn)號為WS/T66-1996)。

羥胺三氯化鐵法測定ChEs得到了廣泛應(yīng)用，但呈現(xiàn)出一定的應(yīng)用局限性，比如不適合通量測定，需在較短時間內(nèi)完成比色測定，容易產(chǎn)生沉淀等。本研究旨在對羥胺三氯化鐵法進(jìn)行條件優(yōu)化，以改進(jìn)上述不足，達(dá)到微孔板測定的目的。

1 材料與方法

1.1 血清標(biāo)本及試劑

本研究中所用到的人體血清標(biāo)本來自寧夏某職業(yè)病防治醫(yī)院在崗期間進(jìn)行職業(yè)健康體檢的長期吸入游離二氧化硅的作業(yè)人員。本研究得到了寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并獲得所有研究對象的知情同意。本研究中用到的主要試劑如表1所示。

表1 膽堿酯酶測定試劑

1.2 方法

1.2.1 羥胺三氯化鐵法測定人血清標(biāo)本中AChE酶活性在參照測定全血膽堿酯酶活性的分光光度法(羥胺三氯化鐵法WS/T66-1996)的基礎(chǔ)上，對部分實驗細(xì)節(jié)進(jìn)行調(diào)整：將凍存于-80 ℃人體血清放置于-4 ℃緩慢融化。對照管和樣品管各加20 μL 人體血清，10 μL iso-OMPA 抑制劑，用PBS 溶液補(bǔ)足至1 mL。使用可見分光光度計(VIS-7220N，北京北分瑞利)測定AChE的吸光度時，用蒸餾水調(diào)零，其余步驟、條件及酶活性計算方法參照羥胺三氯化鐵法(WS/T66-1996)。

1.2.2 羥胺三氯化鐵法測定人血清標(biāo)本中BChE酶活性參照本實驗優(yōu)化的羥胺三氯化鐵法測定AChE 酶活性實驗方案與預(yù)實驗結(jié)果，對部分實驗細(xì)節(jié)微調(diào)：加入血清5 μL，反應(yīng)底物為6.99 μmol/L BTCh 應(yīng)用液，抑制劑為10 μL BW284C51，其余步驟、條件及計算與本研究優(yōu)化的羥胺三氯化鐵法測定AChE 酶活性實驗方案一致。

1.2.3 微孔板羥胺三氯化鐵法測定人血清標(biāo)本中BChE 酶活性做預(yù)實驗以確定最佳稀釋倍數(shù)。稀釋倍數(shù)分別設(shè)為0.2、1.67、5、16.7、50。分別取5 μL不同稀釋倍數(shù)的人血清到微孔板。實驗結(jié)果中，稀釋倍數(shù)為0.2、1.67、5 的血清會產(chǎn)生肉眼可見的沉淀，稀釋倍數(shù)為50 倍的血清無法測出BChE 值。故本實驗取用稀釋16.7倍的血清。所用反應(yīng)底物為6.99 μmol/L BTCh應(yīng)用液。

設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)孔、對照孔、樣品孔。對照孔和樣品孔分別加入5 μL稀釋后血清(稀釋16.7倍)，2 μL抑制劑BW284C51，PBS 溶液補(bǔ)足到20 μL。37 ℃預(yù)熱10 min。對照孔加入80 μL 堿性羥胺溶液和30 μL 應(yīng)用液，樣品孔只加30 μL 應(yīng)用液，37 ℃保溫箱孵育30 min。標(biāo)準(zhǔn)孔中分別加入0、4、8、12、16、20 μL 應(yīng)用液，PBS溶液補(bǔ)足至40 μL(標(biāo)準(zhǔn)孔無需加熱)。樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)孔加80 μL 堿性羥胺溶液振蕩3 min。所有孔中加40 μL 的1+2 HCl 溶液振蕩2 min，之后加入40 μL FeCl3溶液，使用全波長酶標(biāo)儀(Thermo Multiskan GO，Thermo Scientific)測定吸光度值，測定波長為520 nm。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的BChE 酶活性。

1.2.4 改良Ellman 法測定人血清標(biāo)本中BChE 酶活性取5 μL 稀釋后的血清(稀釋倍數(shù)為300 倍)，80 μL Na2HPO4，10 μL DTNB，2 μL BW284C51，蒸餾水補(bǔ)足至150 μL，室溫避光放置30 min，加10 μL濃度為12.5 mmol/L BTCh，40 μL雙蒸水，412 nm酶標(biāo)儀測定吸光度值，吸光度測定間隔2 min，時長10 min，ΔA/min與BChE成正比。

1.2.5 優(yōu)化后方法的準(zhǔn)確性及可靠性驗證為了驗證優(yōu)化后測定方法的準(zhǔn)確性和可靠性，參照羥胺三氯化鐵法(WS/T66-1996)的規(guī)范要求，依次對優(yōu)化后測定方法的最低檢測濃度(檢測限)、線性范圍及變異系數(shù)進(jìn)行了測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 22 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)或中位數(shù)±四分位間距(M±Q)進(jìn)行描述。對于符合雙變量正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，用Pearson積差相關(guān)系數(shù)r 表示相關(guān)性檢驗結(jié)果。對于不符合雙變量正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用Spearman 等級相關(guān)系數(shù)rs表示。使用R語言作圖。雙側(cè)檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 羥胺三氯化鐵法測定人血清中AChE酶活性的靈敏度

羥胺三氯化鐵法測定人血清標(biāo)本中AChE 酶活性的實驗結(jié)果如圖1 所示。結(jié)果表明，在羥胺三氯化鐵法體系中，加入一定劑量的iso-OMPA 后，血清體積與AChE 含量測定值之間并沒有表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。同樣，在微孔板體系中，加入一定劑量的iso-OMPA后，血清體積與AChE 含量測定值之間也沒有表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系。這一結(jié)果給人造成的一種假象是血清體積越大，酶的活性越低。根據(jù)筆者理解，這一結(jié)果或與血清體系中AChE 酶活性含量過低以及體系中其他干擾因素影響測定有關(guān)。這一結(jié)果提示我們，羥胺三氯化鐵法或不適用于人血清AChE酶活性的測定。

2.2 不同方法測定人血清標(biāo)本中BChE酶活性

表2 所示為基于改良Ellman 法進(jìn)行人血清BCHE酶活性測定時最佳稀釋倍數(shù)的確定。判定稀釋倍數(shù)是否理想的依據(jù)是橫向比較同一稀釋倍數(shù)時總ChEs酶活性(測定體系中不加BW284C51)和BChE酶活性(測定體系中加BW284C51)，如果兩者結(jié)果之間具有顯著性差異，視為結(jié)果理想。結(jié)果表明，當(dāng)血清稀釋100 倍且測定體系中加入2 μL BW284C51時，BChE 酶活性的測定結(jié)果最為理想(表2)。

圖1 羥胺三氯化鐵法測定人血清標(biāo)本中AChE酶活性時血清體積與測定結(jié)果的關(guān)系

表2 人血清BChE酶活性測定最佳稀釋倍數(shù)的確定(改良Ellman法)

表3 所示為使用羥胺三氯化鐵法和微孔板羥胺三氯化鐵法測定同一批人血清標(biāo)本中BChE 酶活性的結(jié)果比較。結(jié)果表明，兩種方法均可有效測定血清標(biāo)本中BChE 酶活性，測定結(jié)果之間存在正相關(guān)關(guān)系(rs=0.653，P＜0.01)。

表3 使用不同方法測定同一批人血清標(biāo)本中BChE酶活性的結(jié)果比較

2.3 不同方法測定人血清標(biāo)本中BChE酶活性的相關(guān)性分析

表4所示為不同方法測定人血清標(biāo)本中BChE的相關(guān)性分析。結(jié)果表明，羥胺三氯化鐵法、微孔板羥胺三氯化鐵法與改良Ellman法測定結(jié)果之間均存在正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)；微孔板羥胺三氯化鐵法與羥胺三氯化鐵法測定結(jié)果之間也存在正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。以上結(jié)果提示，羥胺三氯化鐵法與微孔板羥胺三氯化鐵法測定結(jié)果均具有較高的可靠性。

2.4 優(yōu)化后方法的準(zhǔn)確性及可靠性

表5 所示為優(yōu)化前后方法的準(zhǔn)確性及可靠性分析。結(jié)果表明，與羥胺三氯化鐵法(WS/T66-1996)方法相比，微孔板羥胺三氯化鐵法的準(zhǔn)確性及可靠性略佳，主要體現(xiàn)在最低檢測濃度及變異系數(shù)上。

表4 不同方法測定人血清標(biāo)本中BChE的相關(guān)性分析

表5 優(yōu)化前后方法的準(zhǔn)確性及可靠性相關(guān)數(shù)據(jù)

3 討 論

目前的研究中，文獻(xiàn)報道的全血膽堿酯酶活性的分光光度測定方法往往不區(qū)分是何種膽堿酯酶，也沒有加抑制劑的概念[9]。一些研究雖加入抑制劑，卻是用一種抑制劑同時測定AChE與BChE。因兩種膽堿酯酶的生理活性不同，BChE與AChE的反應(yīng)底物結(jié)合能力，BChE 水解BTCh 的速度大于ATCh。所以筆者認(rèn)為，從定量測定AChE與BChE酶活性的角度考慮，應(yīng)該加入相應(yīng)的抑制劑，對酶活性分別檢測。具體地說， 測定BChE 加入AChE 的特異性抑制劑BW284C51，測定AChE 加入BChE 的特異性抑制劑iso-OMPA[10-11]。

在本研究中，加入iso-OMPA 的羥胺三氯化鐵法不適宜測定AChE，可能原因是人體血清中AChE 較BChE 含量甚微，后者大約是前者的10 倍，而該法靈敏度較低。另外加入iso-OMPA 后，底物抑制現(xiàn)象明顯[12]，據(jù)此推測加入iso-OMPA的羥胺三氯化鐵法測定人體血清AChE 效果差。用羥胺三氯化鐵法測定BChE，因人體血清BChE 含量豐富，且底物濃度增加時，BCHE 酶活性變化不明顯。所以用優(yōu)化的羥胺三氯化鐵法測BChE較理想。

如前所述，優(yōu)化的羥胺三氯化鐵法的局限性主要包括不適合通量測定，需在20 min內(nèi)完成比色，容易產(chǎn)生沉淀。優(yōu)化后的微孔板羥胺三氯化鐵法可以有效解決上述問題，表現(xiàn)出一定的方法學(xué)優(yōu)勢(表6)。

表6 不同方法測定人血清中BChE酶活性結(jié)果比較

總之，微孔板羥胺三氯化鐵法是一種通量較高、經(jīng)濟(jì)性較好的測定人血清標(biāo)本中BChE 酶活性的方法，有一定的應(yīng)用前景。