低水平鉛暴露損傷小鼠糖耐量及視網(wǎng)膜血管滲透性促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生

王曉會(huì)，肖 琛，趙和平，吳 賽，夏 冬，柳懷湘，劉潔儀，趙志強(qiáng)，何 云*

(中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州市環(huán)境污染與健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510080)

鉛是自然界、工業(yè)及生活環(huán)境中容易接觸到的一種有毒重金屬。孕婦、兒童等是鉛暴露與吸收的高危人群。近年，大量研究表明鉛暴露并沒(méi)有安全閾值[1]，長(zhǎng)期鉛暴露具有心血管毒性[2]。視網(wǎng)膜血管是反映心血管毒物毒性的良好窗口，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞以及其間的緊密連接等構(gòu)成了血-視網(wǎng)膜屏障，維持視網(wǎng)膜微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病的一種常見(jiàn)微血管并發(fā)癥，成人失明的首要原因。血糖調(diào)節(jié)紊亂，糖耐量損害以及化學(xué)污染物等是促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因子。人群研究提示，糖尿病人群存在鉛暴露水平升高現(xiàn)象[3]，并且在職業(yè)性鉛暴露人群中發(fā)現(xiàn)血清中血管生成因子水平升高[4]。本課題組之前的研究提示，醋酸鉛暴露可以在小鼠體內(nèi)破壞血腦屏障，體外內(nèi)皮細(xì)胞暴露于鉛，緊密連接蛋白2(zona occludens protein-2)、閉合蛋白(occludin)與密封蛋白(claudin-5)等緊密連接相關(guān)分子表達(dá)水平顯著下降[5]。在我國(guó)，盡管鉛污染的關(guān)注與控制水平不斷加強(qiáng)，但持續(xù)性低水平鉛暴露仍是兒童等高危人群健康危險(xiǎn)因子。因此，本研究建立了低劑量鉛暴露C57BL/6J小鼠模型，探討從孕期開(kāi)始到子代成年早期與中期持續(xù)性的低水平鉛暴露對(duì)于小鼠糖耐量及視網(wǎng)膜血管通透性的影響，研究結(jié)果有助于解釋鉛暴露與糖尿病視網(wǎng)膜血管病變的關(guān)系及其機(jī)制，防治糖尿病視網(wǎng)膜病變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

實(shí)驗(yàn)所用48只SPF 級(jí)C57BL6J小鼠購(gòu)于山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK(魯)20140007。本動(dòng)物研究計(jì)劃獲得中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批準(zhǔn)號(hào)2018-011)。36 只雌性小鼠和12 只雄性小鼠，于6周齡時(shí)購(gòu)入，并在屏障環(huán)境中飼養(yǎng)檢疫適應(yīng)1周。小鼠鉛染毒暴露的分組設(shè)計(jì)如圖1 所示。用去離子水分別配制含0、10、100、500 mg/L醋酸鉛的飲用水，7 周齡小鼠隨機(jī)分為4 組，每組均為9 只雌鼠和3只雄鼠，采用容積為250 mL 小鼠飲水瓶供水，每日定時(shí)更換，保持每籠小鼠飲水量一致。8 周齡時(shí)，將同組雌雄鼠按3∶1的比例隨機(jī)合籠。每日檢查雌鼠有無(wú)陰道栓，一旦確認(rèn)懷孕，分籠喂養(yǎng)，并記為孕0.5天。仔鼠于斷奶后在其母鼠暴露水平下繼續(xù)給予醋酸鉛飲用水。每個(gè)醋酸鉛暴露劑量水平，子代小鼠成長(zhǎng)到8周齡時(shí)分為8周組與20周組，每組12只，均雌雄各半。8 周組在此時(shí)收集樣品，利用石墨爐火焰原子吸收法檢測(cè)血鉛，小鼠腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)糖耐量水平，眼底靜脈熒光造影與小動(dòng)物視網(wǎng)膜眼底成像技術(shù)檢測(cè)眼底血管滲透性以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)視網(wǎng)膜血管緊密連接相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平改變；20周組繼續(xù)用醋酸鉛飲用水喂養(yǎng)至20周齡收取樣品檢測(cè)。

圖1 小鼠鉛染毒暴露的分組設(shè)計(jì)

1.2 主要試劑

FITC-Dextran，相對(duì)分子質(zhì)量為70 000，三水合乙酸鉛，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；EDTA抗凝采血管購(gòu)于美國(guó)BD 公司；氯仿、葡萄糖、Tris-HCL、無(wú)水乙醇、戊巴比妥鈉、優(yōu)級(jí)純硝酸、異丙醇購(gòu)于廣州化學(xué)；mRNA 引物購(gòu)于廣州天一輝遠(yuǎn)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa 公司；羥丙基甲基纖維素購(gòu)于沈陽(yáng)興齊眼藥公司；SYBR Premix TaqTM試劑盒購(gòu)于日本TOYOBO公司；Trizol購(gòu)于美國(guó)Life公司；托吡卡胺購(gòu)于參天制藥公司；血糖試紙購(gòu)于北京怡成公司。

1.3 石墨爐原子吸收光譜法檢測(cè)血鉛水平

首先配制鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用5%硝酸稀釋，得到鉛標(biāo)準(zhǔn)梯度濃度為0、5、10、25、50 μg/L。每只小鼠取50 μL 的肝素抗凝血，加入5%的硝酸950 μL，振蕩混勻，室溫下放置15 min 后，15 000 r/min 離心10 min。最后，取鉛標(biāo)準(zhǔn)梯度和800 μL 處理血樣用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定，獲得鉛標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣本血鉛含量。

1.4 腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)檢測(cè)糖耐量

采用怡成5D-1 血糖儀及專用試紙檢測(cè)小鼠尾靜脈血糖水平。收樣前3 d，對(duì)8 周組和20 周組小鼠實(shí)施糖耐量試驗(yàn)，提前禁食12 h，稱重并檢測(cè)空腹血糖水平后小鼠適應(yīng)30 min；然后，小鼠按2 g/kg腹腔注射葡萄糖生理鹽水溶液，分別在15、30、60、90 和120 min 后檢測(cè)血糖水平，計(jì)算血糖隨時(shí)間變化的曲線下面積積分(aera under curve，AUC)。

1.5 小鼠眼底視網(wǎng)膜血管熒光造影檢測(cè)視網(wǎng)膜血管滲透性

使用2%的戊巴比妥鈉預(yù)先麻醉小鼠，使用托吡卡胺滴眼液促進(jìn)并維持瞳孔開(kāi)放，羥丙基甲基纖維素保持小鼠眼睛眼睛濕潤(rùn)。經(jīng)眼后內(nèi)眥靜脈叢[6]按0.25 g/kg 注入熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖(FITC-Dextran)后，立即用小動(dòng)物視網(wǎng)膜活體成像系統(tǒng)拍攝視網(wǎng)膜血管網(wǎng)明場(chǎng)及熒光視野的視頻及照片。

1.6 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)緊密連接相關(guān)分子蛋白轉(zhuǎn)錄

緊密連接是血視網(wǎng)膜屏障的主要組成部分，因此我們檢測(cè)了緊密連接蛋白-1(Zona occludens protein-1，ZO-1)，Occludin與Claudin-1、3、5等緊密連接相關(guān)分子，并以GAPDH 為內(nèi)參。剝離小鼠視網(wǎng)膜，在預(yù)冷的PBS 中漂洗，使用Trizol 抽提視網(wǎng)膜總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，各基因的引物序列如表1所示。各基因轉(zhuǎn)錄水平按照SYBR Premix TaqTM試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行qPCR反應(yīng)體系配制，最后使用2-ΔΔCT法對(duì)其相對(duì)定量并進(jìn)行組間比較。

表1 qPCR引物序列表

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，3組或以上樣本采用單因素方差分析(ANOVA)，線性回歸分析分析醋酸鉛外暴露與血鉛水平的關(guān)系，以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同醋酸鉛暴露水平對(duì)小鼠血鉛水平的影響

醋酸鉛染毒8 和20 周組小鼠的血鉛水平如圖2 所示，隨著飲水中醋酸鉛濃度的升高，小鼠血鉛濃度與對(duì)照小鼠相比顯著升高，存在劑量反應(yīng)關(guān)系(r8周組=0.887，r20周組=0.972，P 均＜0.05)。值得注意的是，在100 mg/L 劑量以下，染毒8 周組小鼠的血鉛濃度高于染毒20 周組(P＜0.05)；在500 mg/L 劑量下，染毒8 周組小鼠的血鉛濃度低于染毒20周組(P＜0.01)。

圖2 不同濃度醋酸鉛染毒8和20周的小鼠血鉛濃度的變化

2.2 不同醋酸鉛暴露水平對(duì)小鼠糖耐量的影響

染毒8和20周小鼠空腹腹腔注射葡萄糖后，血糖變化及其血糖隨時(shí)間變化曲線下面積積分AUC 比較，如圖3 所示，鉛暴露小鼠2 h 血糖值高于對(duì)照組小鼠。鉛暴露小鼠AUC 高于對(duì)照組小鼠(P＜0.05 或P＜0.01)。在染毒8 周組，小鼠血糖及AUC 在10 mg/L 醋酸鉛染毒時(shí)與對(duì)照組差異最明顯，而在染毒20周組小鼠在100 mg/L醋酸鉛染毒時(shí)與對(duì)照組差異最明顯。

圖3 不同濃度醋酸鉛染毒8和20周的小鼠糖耐量的變化

2.3 不同醋酸鉛暴露水平對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管滲透性的影響

相對(duì)分子質(zhì)量為70 000的FITC-Dextran與血清白蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相近，已應(yīng)用于評(píng)估血管滲漏性。如圖4A～D所示，在染毒8周組，小鼠暫未出現(xiàn)明顯視網(wǎng)膜血管滲漏病灶。圖4E～H 所示，在染毒20 周組，100 與500 mg/L 醋酸鉛染毒劑量下，小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)明顯的滲漏病灶。

圖4 不同濃度醋酸鉛染毒8和20周的小鼠視網(wǎng)膜血管滲漏情況

2.4 不同醋酸鉛暴露水平對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接的影響

緊密連接是血視網(wǎng)膜屏障的主要組成部分，緊密連接組成組分分子的表達(dá)改變會(huì)嚴(yán)重影響緊密連接功能，進(jìn)而改變血管滲透性。因此我們檢測(cè)了ZO-1，Occludin與Claudin-1、3、5等緊密連接相關(guān)分子，采用qPCR 技術(shù)檢測(cè)了視網(wǎng)膜組織中ZO-1，Occludin 和Claudin-1、3、5等蛋白分子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖5 所示。在染毒8 周組，隨著醋酸鉛濃度升高，ZO-1 與Claudin-1、3、5 蛋白分子轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，而Occludin 蛋白分子的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平受到抑制，與對(duì)照組小鼠相比差異顯著(P＜0.05 或P＜0.01)。在染毒20周組，隨著醋酸鉛濃度的升高，ZO-1，Occludin 和Claudin-1、3、5 蛋白分子的mRNA 轉(zhuǎn)錄被廣泛抑制，與對(duì)照組小鼠相比差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。

3 討 論

鉛作為一種化學(xué)污染物，其顯著毒性在神經(jīng)系統(tǒng)與血液系統(tǒng)，近年來(lái)，慢性鉛中毒引起的代謝毒性與心血管毒性受到關(guān)注[2-3，7-8]。鉛經(jīng)過(guò)生活飲用水、空氣、食品和工業(yè)品等介質(zhì)進(jìn)入人體，飲用水是主要途徑之一。我國(guó)多次出現(xiàn)工廠違規(guī)排污導(dǎo)致地表水受含鉛等重金屬污染事件[9]；另一方面，供水管道內(nèi)易發(fā)生鉛溶出導(dǎo)致家庭飲用水等受到鉛污染[10-11]。胎兒和兒童是環(huán)境鉛暴露高危人群[8，12]。早期研究提示，100 mg/L鉛暴露即可導(dǎo)致視覺(jué)功能受損及視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)損害[13-14]。500 mg/L 醋酸鉛成年期暴露ZDF 肥胖大鼠空腹血糖出現(xiàn)升高，糖耐量受損[15]。本研究結(jié)果顯示，幼年期或成年期小鼠暴露于500 mg/L醋酸鉛均可破壞小鼠血腦屏障，導(dǎo)致腦組織滲透性顯著升高。體外研究提示，腦內(nèi)皮細(xì)胞暴露于鉛，會(huì)導(dǎo)致緊密連接相關(guān)蛋白分子ZO-2，Occludin 與Claudin-5 表達(dá)水平顯著下降[5]。近年體內(nèi)研究提示，成年期SD大鼠暴露于200 mg/L醋酸鉛可能導(dǎo)致血視網(wǎng)膜屏障被破壞，外源示蹤劑Evans Blue 滲漏增加，其Occludin 與Claudin-5等緊密連接蛋白表達(dá)受到抑制[16]。而幼年期鉛暴露對(duì)于視網(wǎng)膜血管與糖代謝的影響卻缺乏證據(jù)，因此，研究幼年期飲水鉛暴露更具有重要公共衛(wèi)生意義。

圖5 不同濃度醋酸鉛染毒8周和20周的小鼠視網(wǎng)膜緊密連接相關(guān)蛋白分子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化

血鉛能較好地反映近期鉛暴露水平，染毒8 周組反映了幼年期小鼠對(duì)鉛暴露更敏感，吸收度高而排泄能力不足。進(jìn)入成年期后，小鼠對(duì)鉛暴露敏感度下降而排泄能力更強(qiáng)。結(jié)果顯示，在0～100 mg/L范圍內(nèi)成年期小鼠血鉛更低，而較高的500 mg/L暴露水平呈現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)，反映了鉛排泄的失代償。

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病的主要并發(fā)癥類型。高血糖，糖耐量損傷及化學(xué)污染物等是其主要危險(xiǎn)因素[7，17]。整體上，從染毒8 周與20 周兩組小鼠對(duì)照水平比較提示，成年小鼠空腹注射葡萄糖后血糖及AUC更低，AUC越低，對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力越強(qiáng)。小鼠在幼年期，糖耐量試驗(yàn)中與對(duì)照組相比，醋酸鉛染毒小鼠血糖更高，AUC更高，反映了血糖調(diào)節(jié)能力更低。在染毒8 周組，小鼠血糖調(diào)節(jié)能力在10 mg/L 醋酸鉛濃度下改變最明顯，其并不簡(jiǎn)單的表現(xiàn)為線性劑量反應(yīng)關(guān)系。進(jìn)入成年期后，小鼠本身的糖耐量能力是增強(qiáng)的，在0～100 mg/L 劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，小鼠血糖調(diào)節(jié)能力在100 mg/L醋酸鉛濃度下改變最明顯。總體上，鉛暴露會(huì)一定程度上破壞小鼠的血糖調(diào)節(jié)能力。幼年期極低劑量的鉛暴露即可導(dǎo)致糖耐量的損害。進(jìn)入成年期，鉛暴露仍然會(huì)導(dǎo)致血糖調(diào)節(jié)能力下降，但其對(duì)鉛暴露的敏感劑量提高，但其損害程度相較幼年期無(wú)顯著地差異。這提示，幼年期極低劑量的鉛暴露對(duì)機(jī)體糖代謝的損害更為危險(xiǎn)。也再次提示鉛暴露沒(méi)有“安全劑量”。鉛暴露導(dǎo)致的血糖調(diào)節(jié)能力下降，間接可能促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生。

本研究進(jìn)一步直接觀察了鉛暴露對(duì)于視網(wǎng)膜血管滲透性的影響。在染毒8 周組幼年期階段，緊密連接相關(guān)分子ZO-1，Occludin 與Claudin-1、3、5 等在鉛暴露的刺激下，呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄先增加后減少的表現(xiàn)，體現(xiàn)了血管應(yīng)對(duì)外界刺激的一種應(yīng)激代償反應(yīng)，血管間的緊密連接并未失代償，血視網(wǎng)膜屏障保持其功能完整良好。在染毒20周組，進(jìn)一步在成年期鉛暴露導(dǎo)致了緊密連接的破壞，功能失代償，血管出現(xiàn)滲漏表現(xiàn)。提示，鉛暴露可直接損傷血視網(wǎng)膜屏障，并引起滲漏，其部分機(jī)制可能涉及緊密連接的破壞。這些結(jié)果與先前在成年期SD大鼠的結(jié)果相印證[16]，這表明鉛暴露對(duì)于血視網(wǎng)膜屏障的破壞是進(jìn)展性的，幼年期雖然已經(jīng)存在分子水平變化，但并不敏感。持續(xù)的鉛暴露，在成年期后會(huì)直接損害血視網(wǎng)膜屏障，導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜血管病變等疾病的發(fā)生。

綜上所述，在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)極低的鉛暴露劑量仍然存在健康風(fēng)險(xiǎn)，幼年期的鉛暴露在極低劑量條件下就能導(dǎo)致小鼠血糖調(diào)節(jié)能力下降。長(zhǎng)期鉛暴露可以直接誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管損傷，其機(jī)制可能涉及緊密連接的破壞。