葡萄酒冷穩定測試方法及研究進展

李秀秀，夏廣麗*

（濱州醫學院藥學院（葡萄酒學院），山東煙臺 264003）

葡萄酒中天然存在酒石酸鹽，主要成分包括酒石酸氫鉀（KHT）和酒石酸鈣（CaT）。葡萄汁經發酵轉變成酒后，其中的酒石酸鹽處于飽和狀態，易隨溫度等條件的變化而析出，形成晶體沉淀[1]。葡萄酒中的沉淀對于消費者來說是不可接受的質量缺陷，所以生產上通過特殊工藝處理來保證酒的冷穩定性（Cold Stability）。CaT的溶解度受酒精度的影響顯著，溫度變化對其影響有限；而KHT的溶解度同時受溫度和酒精度的影響[2-3]，且含量占酒石酸鹽的絕大部分，是影響葡萄酒冷穩定的主要因素。

葡萄酒KHT穩定性處理工藝有兩大類型：（1）基于誘導的二次成核動力學的靜態和動態的“減法”過程，（2）通過增加葡萄酒天然酒石酸鹽保持能力的“加法”過程[4]。“減法”過程中的冷凍處理工藝是將葡萄酒的溫度降至接近冰點，即零下-4～5 ℃，保持幾天或1～2周的時間，然后保溫過濾去除析出的KHT晶體，使葡萄酒達到冷穩定狀態。因為冷凍法耗能、耗時[5]，近年離子交換法以及電滲析法也被開發出來，逐步投入生產中[6]。人們對于“加法”過程持續進行了研究：包括偏酒石酸（MTA）、甘露糖蛋白（MP）、羧甲基纖維素鈉（CMC）[7-9]、以及天冬氨酸（KPA）等[10]。“加法”過程并非去除葡萄酒的KHT，而是利用添加劑對葡萄酒酒石酸鹽的保持能力，抑制KHT沉淀。不同添加劑效果各有特點：偏酒石酸適合貨架期短的產品，在通常儲存條件下（10～18 ℃）的貨架期為12～18個月[5]；甘露糖蛋白來自于酵母，系葡萄酒中天然存在的成分[11]；羧甲基纖維素鈉在保證紅葡萄酒色素穩定方面差強人意；聚天冬氨酸處理的葡萄酒電導率變化小，濁度顯著降低，色度有改善，是一個發展方向[12-13]。“加法”過程可以避免傳統冷凍法電能的消耗以及生產周期的延長，減輕對葡萄酒感官質量的不利影響，降低生產成本。但上述添加劑在國內還沒有獲得使用許可，需要科研及法規方面的工作來推動其在中國的應用。

葡萄酒生產者通過冷穩定測試來判斷葡萄酒是否穩定，以指導生產。鑒于冷穩定是一個相對的概念，目前有幾種常見的測試方法，但不同方法的置信度不同。孫建平等[14]比較了電導率法、飽和溫度法，以及冷藏法，發現不同的測試方法判定標準不能統一。劉振來等[15]對電導率法和飽和溫度法進行了驗證分析。但全面闡述冷穩定測試方法還未見報道。本文比較5種冷穩定測試方法的原理、方法和適用范圍，并介紹相關研究進展，以期為實際生產的工藝控制提供有益借鑒。

1 冷穩定測試方法

1.1 冷凍-融化法（Freeze-thawing Test）

原理：冷凍-融化法是根據KHT溶解度受溫度影響的特性，直接采取降溫促使酒石結晶析出的破壞性試驗，并直接用視覺檢查晶體是否形成的方法。該方法并非模擬成品酒的實際儲存狀態，結果只是對葡萄酒當前穩定性的定性預測。

方法：葡萄酒經過冷穩定處理后，在過濾之前，取樣測試。樣品無菌過濾后，注入玻璃管或試劑瓶中開始冷凍。需要注意的是取樣后立即在低溫下進行過濾，以避免酒樣升溫導致結果出現假陽性[16-17]。樣品所需的冷凍時間取決于葡萄酒中的酒精含量。通常將葡萄酒放在冰箱中4～16 h不等，具體時長取決于產品酒精度含量及生產者對冷穩定程度的經驗和要求[18]。

將樣品從冰箱中取出，在室溫下解凍。樣品液化的同時，在強光下檢查是否有晶體形成的跡象。如果出現晶體，則在達到室溫后對樣品進行重新檢查，以確認晶體是否溶解。解凍后或室溫下沒有晶體，則表明葡萄酒冷穩定[16]。為方便觀察，通常同時保留一個對照酒樣用于比較。

酒樣的無菌過濾采用的過濾膜孔徑應與實際生產中使用的相一致，通常白葡萄酒采用的孔徑尺寸為0.45 μm，紅葡萄酒采用的為0.65 μm。

該方法的結論是定性的“通過”或“不通過”。“通過”是指無菌過濾的葡萄酒樣品或經無菌過濾的成品葡萄酒在任何一次檢查中都沒有出現晶體；或者在第一次檢查（融化）時發現晶體，但是在室溫下晶體溶解（取決于釀酒師）。反之則為“不通過”。

可能出錯的情況：冷凍時間不足；樣品溫度偏高；過濾不正確；沒有在正確的時間觀察樣品；人工加熱的樣品；冰晶被誤認為是酒石酸鹽晶體。

適用范圍：該法不需要復雜的儀器設備，降溫設施用普通冰箱即可。因為操作簡單，目前依然有很多酒廠采用。

在起泡葡萄酒和強化葡萄酒的生產中，因為酒精度變化幅度明顯，影響到最終產品中酒石酸鹽的溶解度，實驗時需進行調整。起泡酒做冷凍-融化法測試時，需強化1%～1.5%的酒精，以模擬二次發酵后實際的酒精度含量[4]。

該方法適用于傳統冷凍的“減法”過程，不適用于加法“過程”，比如以CMC處理的葡萄酒。

1.2 冷藏法（Refrigeration Test）

原理：冷藏法同樣是基于KHT溶解度隨溫度變化的特性，降低樣品溫度至冰點附近進行測試。與冷凍-融化法的區別是，樣品測試通常在不結冰的狀態下進行，保持幾天甚至幾周的時間，以視覺觀察是否有KHT晶體析出。葡萄酒的冰點計算公式如下：

冰點T ℃＝-（酒精度－1）/2

方法：具體取樣與過濾操作同冷凍-融化法，但不使樣品凍結。不同的酒廠采用的測試溫度與保留時間參數有所不同：在0 ℃，保持1周；在-2 ℃，保持72 h；或者在-4 ℃，保持24 h等[18]。其中，將過濾后的葡萄酒樣品置于冰浴鍋內的冷凍（鹽水）測試，-4 ℃保持3 d，然后檢查晶體沉淀情況，也被稱為“鹽水”測試。有研究發現，這種“鹽水”測試方法得出的結論與在酒窖條件下儲存一年的葡萄酒的穩定性最接近，可以提供可靠的結果[19]。

適用范圍：同冷凍-融化法一樣，操作簡單，不需要復雜設備，這是優點。但僅能得出定性的結果，如果結論是不通過，不能給出具體不穩定程度的參數。同樣對最終酒精度有變化的樣品，例如起泡葡萄酒，需采用強化酒精，以模擬最終產品酒精度。結果僅能說明葡萄酒的當前穩定性，而非長期穩定性[20]。

但該法比冷凍-融化法適用的范圍要廣，因為測試過程樣品未達到冷凍狀態，所以一部分“加法”過程的處理工藝也可以用。缺點是生產工藝處理需對測試結果等待時間較長。

1.3 電導率/微接觸法（Conductivity Test/ Mini Contact Test）

原理：葡萄酒中的游離K+會因酒石的沉淀析出而損失，從而導致葡萄酒電導率發生變化。在一定的溫度下，添加酒石“晶種”，使酒石酸氫鉀過飽和而沉淀析出，再通過測定電導率變化，可預測葡萄酒的冷穩定性。微接觸法最早被提出是利用稱重法，通過確定增加酒石重量的多少來判定穩定性。因為操作復雜，逐步被改良。目前是通過檢測電導率的變化來判定結果，與電導率法類似。但電導率法通常用電導率變化值的百分比來評價結果，而所謂的微接觸法通常用具體的電導率變化數值來評價。

方法：測試需要的儀器包括電導率儀（量程100～1000 μS；）、0 ℃（±1.0 ℃）的恒溫冰浴裝置，及過濾裝置等。

檢測時，先開啟攪拌，校準電導率儀（大約10 min）。將冷藏的葡萄酒樣，立即進行無菌過濾并脫氣，然后置于0 ℃（±1.0 ℃）的冷浴中。測試過程中持續攪拌，保持樣品溫度恒定。將電導率探頭插入樣品中，并在達到測試溫度時讀取電導率（C1）。將KHT粉末加入到冷卻的樣品中，并攪拌幾分鐘。當葡萄酒的電導率值穩定時，記錄電導率讀數（C2）。初始讀數（C1）和添加后讀數（C2）的電導率變化比率將指示所測樣品的穩定性水平。

注意事項：在測試溫度下，電導率值不穩定且持續降低，說明所測樣品不穩定；電導率達到并保持穩定值的樣品是穩定的。測試結論僅適用于測試溫度或以上，如果葡萄酒儲存溫度低于測試溫度，則仍有可能不穩定，故測試應該在盡可能低的溫度下進行。有測試方法選擇白葡萄酒在0 ℃下進行測試，紅葡萄酒在5 ℃下進行測試，KHT的粒度應在40～70 μm[18]。

可能出錯的情況：樣品溫度不準確、儀表或探頭故障、無法攪拌樣品、計時和儀表讀數不正確、沒添加KHT、過濾操作不當、樣品過濾溫度不適合。

結果判定：

（1）電導率法判定標準，采用的計算公式如下：

電導率的變化△λ小于3%～5%，則表示葡萄酒穩定[16, 21]。

（2）微接觸法判定標準，采用的計算公式為：

不同的研究者設定的略有差別。例如GUISE采用的微接觸測試判定標準為：如果電導率的變化值△λ＜30μs/cm，則非常穩定；△λ變化值介于30～50μs/cm為穩定；△λ變化值介于50～70μs/cm為警告；△λ＞70μs/cm則為不穩定[22]。

適用范圍：該法檢測用時短，屬定量分析。可用于直接冷凍、電滲析、以及外源添加KPA、CMC等的冷穩定測試，適用范圍廣泛。

1.4 飽和溫度法（Saturation Temperature，Ts）

原理：葡萄酒的飽和溫度（Ts）是指可以溶解KHT的最低溫度，亦即溶質（KHT）在溶液（葡萄酒）里達到飽和狀態時的溫度[1]。在一定的范圍內，超過或低于這個溫度將會使溶液由飽和狀態變為不飽和狀態或者由不飽和狀態變為飽和狀態，使溶液中的溶質晶體溶解或析出。Ts值越低，葡萄酒就越穩定；Ts值越高，KHT沉淀就越容易發生。VALLEE提出了飽和溫度法來判斷葡萄酒的酒石穩定性[23]。

飽和溫度法即通過測定葡萄酒的飽和溫度Ts，與既定的“Ts判定標準”比對來判定穩定性的檢測方法。“Ts判定標準”理論上為葡萄酒在正常儲存條件下不出現酒石酸鹽沉淀的飽和溫度上限值。

方法：測試需要的儀器包括電導率儀（量程為100～1000μs）、控溫及樣品攪拌裝置。控溫單元用來調節樣品溫度，保證檢測過程中實現先是對樣品降溫，隨后將酒樣以穩定的速度升溫的過程。

白葡萄酒：在電導率儀中把葡萄酒溫度降到5 ℃，然后逐漸升溫到25 ℃，在升溫過程中，按既定的溫差記錄溫度和電導率。同樣條件需要做兩個樣品，一個對照樣品，一個加4 g/L KHT的酒樣，將兩個酒樣的結果在同一坐標系中，繪制成溫度-電導率曲線圖，得到飽和溫度曲線，兩條曲線明顯分開時的交點就是樣品的飽和溫度Ts[23-25]；升溫速度應該穩定，DOS SANTOS選擇的升溫速度為0.5 ℃/min[24]。曲線繪制參照圖1。

紅葡萄酒：初始溫度降到10 ℃，升溫至30 ℃，其它操作同白葡萄酒。

對白葡萄酒的Ts判定是10 ℃，即Ts＜10 ℃時為穩定， Ts＞10 ℃時不穩定；對紅葡萄酒的Ts判定是16 ℃，即Ts＜16 ℃時穩定，Ts＞16 ℃時不穩定。

適用范圍：適用于包括電滲析處理[26]的大多數冷穩定處理的測試，但對于利口酒（雪利酒）應用受限[22]。研究結果表明，結晶抑制劑不會影響鹽的溶解，Ts值不會因陳釀過程中發生的變化而改變[4]，因此飽和溫度法Ts預測的是葡萄酒長期穩定性。

1.5 離子濃度積法（Concentration product，CP）

原理：基于根據溶解度可預測溶質沉淀的原理，根據葡萄酒中KHT的K+和HT-的離子濃度積來預測冷穩定，即離子濃度積法。KHT的離子濃度與酒石酸在葡萄酒中的電離平衡直接相關，而電離平衡主要受pH、酒精影響。 BERG以模擬酒試驗在不同pH、酒精度的條件，HT-在H2T中的占比，制定了HT-（%）與pH、酒精度的關系表。在此基礎上，通過檢測樣品K+、總酒石酸H2T的含量，以及酒精度與pH，即可計算出離子濃度積CP數據，與表1的推薦數據對比即可預測酒石穩定性[27]。

方法：檢測葡萄酒樣中K+、H2T、pH和酒精度，以后3項的數據得出HT-數值，從而計算出葡萄酒中的離子濃度積CP。

CP的計算公式如下：

其中：K+、H2T單位為g/L；HT-(%)值為百分數，系查表得出（表略）。

結果判定：與表1中數值比較，如果相應樣品CP值高于建議數值，則說明葡萄酒酒石不穩定。

適用范圍：CP法測試需要用到原子吸收或火焰光度儀檢測鉀離子濃度，對一般酒廠來說儀器配置與檢測人員的要求偏高。CP法僅是對酒石酸鹽離子檢測，不能同時評估蛋白、單寧等保護膠體對冷穩定的影響，測試結果置信度偏低。綜上，CP法目前在實際生產中的使用比較少。

2 討論與進展

葡萄酒冷穩定雖然主要與KHT有關，但也受其它大分子膠體成分影響。目前冷穩定測試方法各有特點，科研人員針對測試方法的局限性與不足，開展了相關的研究，部分研究進展介紹如下：

Gomez Benitez等[28]依據雪利酒的酒石酸氫鉀中的飽和度更高的現象，對比了飽和溫度（Ts）法和微接觸法的結果，發現微接觸法可作為一種快速、可靠地確定雪利酒酒石酸穩定性的方法。

Henriques等[29]開發了受控的冷凍-融化測試法，以獲得電滲析處理葡萄酒所需的去離子度（Deionization degree，DD）參數，所得結果具有重現性，可用于指導生產。具體方法是將樣品在-20 ℃下冷凍并控制結晶核，保溫24 h，隨后在0 ℃解凍。去離子度是通過測定葡萄酒在0 ℃時的初始和最終電導率確定。

表1 不同葡萄酒在0 ℃冷穩定最高CP限值Table 1 Maximum CP limit of cold stability of different wines

Bosso等[30]研發了一種改良微接觸測試方法。該方法是在測試酒樣中添加過量KHT（10 g/L），保持0 ℃的恒溫狀態下，攪拌4 min，測試葡萄酒的電導率（△λ）下降。并定義了明確的測試操作條件，添加的KHT晶體類型和劑量，從而降低了檢測成本，大幅縮短了檢測時間，簡化了測試管理。通過比較微型接觸測試和冷凍測試的結果，定義了閾值穩定性值：白葡萄酒的△λ＜5%，紅葡萄酒和桃紅葡萄酒的△λ＜4%； 對于特別富含多酚類化合物的紅酒，△λ＜3%。

飽和溫度法的“Ts判定標準”沒有一個統一的數值，這是因為KHT的亞穩性和晶體生長抑制劑的存在，Ts值與實際穩定溫度不符，且存在一定程度的差異[25]。王樹生等[31]以國產葡萄酒為試驗對象，對“Ts判定標準”進行了驗證，得出白葡萄酒Ts是10 ℃，紅葡萄酒的Ts是16 ℃，推薦該標準可用于指導生產的結論。Lambri等[3]研究了模擬酒中蛋白質與單寧的含量發現，隨著蛋白質單寧比的降低，酒石酸鹽的保留能力增加。單寧濃度的增加使飽和溫度Ts值降低，從而使過飽和度范圍變窄，而僅蛋白質的存在增加了過飽和度的范圍，使Ts值增加。Berta[32]給出了“Ts判定標準”范圍，白葡萄酒在5～12.5 ℃，紅葡萄酒在10～21.1 ℃，即Ts低于此范圍是穩定的。呂振榮等[33]試驗表明，紅葡萄酒Ts低于15 ℃、白葡萄酒Ts低于12 ℃是穩定的。葡萄酒生產者需根據自己葡萄酒的特點來確定“Ts判定標準”。

葡萄酒酒石的穩定性受大分子膠體等多種成分與因素的影響，一種測試方法常常不能滿足生產對于準確性的要求，一些復合方法被開發出來：劉振來等[15]經試驗確定其選用的電導率法與飽和溫度法復合指標來預測葡萄酒的冷穩定：（1）電導率差△λ＜25μS/cm；（2）飽和溫度Ts：白葡萄酒Ts＜10.5 ℃時穩定，Ts＞10.5 ℃時不穩定；紅葡萄酒Ts＜20 ℃時穩定，Ts＞20 ℃時不穩定；（3）飽和溫度曲線走向：飽和溫度的二條曲線在相交之前應該結合緊密或稍有分離，如果分離過大則有沉淀危險。當同時符合以上3個條件時，說明葡萄酒酒石穩定，如有一條不符，則有酒石沉淀危險。

澳大利亞葡萄酒研究所AWRI建議通過在- 4 ℃下保持3 d的冷藏（鹽水）測試和Ts測試相結合，可獲得有關酒石穩定性的最可靠信息，因這兩種測試相結合可得出葡萄酒的當前穩定性及其潛在的長期穩定性[34]。

3 結論

冷穩定測試是對葡萄酒冷穩定狀態的一個預測，不同測試方法置信度不同。

冷凍-融化法具有操作簡單，用時短（當天或兩天即可出結果）的優點，缺點是結果僅能定性，且對于“加法”工藝處理的酒大部分不適用。

冷藏法與冷凍-融化法不同之處是酒樣不結冰，能適用部分“加法”工藝的測試。缺點是通常用時長（一周左右出結果）。

電導率（微接觸）法通過葡萄酒電導率的變化來預測葡萄酒的穩定性，系定量檢測，結果可靠，測試速度快，適用范圍廣，可推廣使用。

飽和溫度法同樣是基于電導率的測定，系定量檢測，測試速度快，適用范圍比較廣。但判定標準Ts會受到葡萄酒中酒精、單寧、蛋白等成分的影響，對于酒精度高的特種酒應用受限。

離子濃度積法是根據葡萄酒中KHT的離子濃度來判斷冷穩定性，優點是屬于定量分析，缺點是需要復雜的檢測硬件設施，對人員的操作水準要求高，應用受限。

由于葡萄酒的復雜性，一種測試方法不能滿足生產指導要求，一些改良的測試方法，甚至兩種或兩種以上方法結合使用的方法被研發出來。生產者可結合自己產品與工藝特點選擇適合的方法。