膠體金免疫層析技術在食品安全現場快速檢測中的應用

翟培 韓晉輝

摘要 ? ?膠體金免疫層析技術具有操作簡單、價格低廉、特異性和靈敏度較高、肉眼易判斷、檢測時間短等特點，非常適合用于食品安全現場快速檢測。本文從動物源性食品及植物源性食品兩方面，對利用膠體金免疫層析技術進行食品安全基層監管以及食品企業原料現場快速檢測應用研究進行了綜述，并對膠體金免疫層析技術應用發展進行了展望。

關鍵詞 ? ?膠體金免疫層析技術;食品安全;現場快速檢測

中圖分類號 ? ?TS207.7 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）04-0225-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract ? ?Colloidal gold immunochromatography assay ?has the characteristics of simple operation，low price，high specificity and sensitivity，easy judgment by the naked eye，and short detection time.It is very suitable for on-site rapid detection of food safety.This article reviewed the research on the application of colloidal gold immunochromatography assay for primary supervision of food safety and on-site rapid detection of raw materials of food companies from animal-derived food and plant-derived food.The application development of colloidal gold immunochromatography assay ?was ?prospected.

Key words ? ?colloidal gold immunochromatography assay;food safety;on-site rapid detection

近年來，國家非常重視食品快速檢測技術，在《食品安全法》《實用農產品市場銷售質量安全監督管理辦法》《食品快速檢測方法評價技術規范》等相關法律法規中對利用食品快速檢測技術進行食品安全檢測監管進行了規定和規范[1]。

作為快速檢測中重要的一部分，食品安全現場快速檢測簡單便攜、成本比較低廉[2]，能夠在產品倉庫、生產場地、銷售地點等現場對大批量的樣品進行快速篩查（圖1），極大地提高了食品安全監督、檢驗的效率，符合食品企業內部產品品質控制以及基層監管部門對食品質量安全管理的實際需求。

膠體金免疫層析技術（colloidal gold immunochromatogr-aphy assay，GICA）是將膠體金標記技術、免疫檢測技術和蛋白層析技術相結合，以硝酸纖維膜（nitrocellulose filter mem-brane，簡稱NC膜）為載體的快速固相膜免疫分析技術[3]。該技術將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上之后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑之后相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可以通過肉眼觀察到顯色結果[4-5]。以膠體金為免疫標記物方法的優點是操作簡單、價格低廉、特異性和靈敏度比較高、肉眼容易判斷、檢測時間比較短，特別適合廣大基層和大批量現場篩查。

1 ? ?GICA在動物源性食品現場快速檢測中的應用

1.1 ? ?GICA在畜禽肉制品現場快速檢測中的應用

目前，主要集中在動物疫病和獸藥殘留現場篩查，以及致病菌污染快速檢測等方面。

1.1.1 ? ?在動物疫病現場篩查方面。針對引起動物疫病的病毒病菌進行檢測，并和常規檢測方法進行對比，明確GICA在現場篩查檢測過程中的應用性。吳海濤等[6]針對2018年全國范圍暴發的一類動物疫病非洲豬瘟（ASF），以原核表達的ASFV PET-30A-P72蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔制備血清，以ASFV單克隆抗體雜交瘤細胞株2D3接種至Balb/c小鼠腹腔內制備腹水，獲得能在5～10 min內檢測出含有非洲豬瘟病毒（ASFV）陽性抗原的膠體金試紙。Jiang等[7]利用雙抗夾心GICA制備檢測豬口蹄疫病毒測試條，其檢測靈敏度可以達到11.7 ng/mL，檢測時間控制在15 min以內。楊旭欣等[8]針對羊布魯氏菌病進行研究，對299份羊血清同時利用GICA、虎紅試管凝集試驗（RBPT）和試管凝集試驗（SAT）進行檢測，其結果基本一致，進一步肯定了GICA在現場替代傳統檢測手段的可能性。張少華等[9]針對豬肉中寄生蟲病，以膠體金標記豬帶絳蟲六鉤蚴TSOL18重組蛋白抗原研制出檢測豬帶絳蟲的GICA試紙條，在5～15 min內簡便快速獲得準確結果，適用于一般的基層單位、養殖場對豬囊蟲病常規實驗室診斷和流行病學調查。

1.1.2 ? ?在獸藥殘留現場篩查方面。利用GICA技術對食品動物中違禁、殘留獸藥進行快速檢測，并通過精密儀器復檢，證明GICA技術在獸藥殘留現場篩查的實用性。吳雨豪等[10]以65 nm多枝狀膠體金（Au NFs）為新型探針，研制檢測豬尿中新型瘦肉精沙丁胺醇（SAL）的試紙條，僅需1臺便攜式讀取儀，17 min內即可實現豬尿中SAL的高靈敏定量檢測，其檢測SAL的IC50值可達到0.143 ng /mL，豬尿樣品最低檢測限為0.027 ng /mL，適于SAL的現場快速篩查檢測。趙興然等[11]針對動物和水產養殖中常見的禁用藥氨苯砜（DDS），依據免疫競爭法原理，建立了膠體金滲濾式試紙條快速檢測方法，通過簡單前處理，在10 min內可目測進行定性判斷，最低檢出限可達到20 μg/L，同時利用高效液相色譜法進行了試驗結果驗證，證明該方法檢測結果準確，操作簡便快速，適用于大批量臨場動物性食品中氨苯砜殘留的快速定性檢測。高素敏[12]針對禽類產品中易濫用易殘留的獸藥磺胺嘧啶進行膠體金免疫層析試紙條研制，通過對當地采集的100份雞肉樣品進行檢測并利用高效液相色譜法進行陽性樣品復檢，進一步證明GICA具有操作方便、靈敏度高、檢測快速的效果，克服了傳統檢測方法的缺陷，有著較好的應用前景。

1.1.3 ? ?在致病菌污染快速檢測方面。主要利用GICA克服傳統微生物檢測時間長、人員及設備要求高、不能進行現場快速檢測等缺點，實現對動物源性產品致病菌及其毒素污染的簡單便捷快速檢測。趙 ?鑫等[13]針對在冷鮮肉中容易存活的致病菌單增李斯特氏菌，制備單克隆抗體，利用雙抗夾心免疫原理制備出可檢測單增李斯特菌的膠體金免疫層析試紙條，檢測限可達到1×106 CFU/mL，與常見的食源性致病菌無交叉反應。張 ?帥等[14]利用免疫學技術，制備了特異性單克隆抗體和多克隆抗體，研制出膠體金免疫層析試紙條能夠同時對鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌和福氏志賀氏菌這3種畜禽生鮮肉中最常見致病菌進行定性和半定量快速檢測，檢測靈敏度可以達到1×104 CFU/g，最大程度地降低檢測成本。劉 ?晶等[15]針對畜禽肉制品中危害較大不易去除的金黃色葡萄球菌腸毒素A（SEA）和B（SEB）建立雙抗體夾心免疫層析測試卡檢測法，能夠在10 min內進行定性和半定量檢測，對SEA的檢測范圍為10～100 ng/mL，靈敏度達到10 ng/mL;對SEB的檢測范圍為1～100 ng/mL，靈敏度達到1 ng/mL，以攜帶方便、使用簡單、判定準確、結果客觀、易保留的特點滿足現場進行細菌毒素快速檢測的要求。

1.2 ? ?GICA在食用水產品現場快速檢測的應用

GICA在食用水產品中的應用主要集中在疫病病原、藥物殘留和水產毒素的現場快速檢測。

1.2.1 ? ?在疫病病原的快速檢測方面。主要利用GICA對水產養殖以及食用水產品中常見的病原菌進行快速檢測。辛志明等[16]針對嚴重危害我國淡水養殖業的病原菌豚鼠氣單胞菌制備出膠體金免疫層析試紙條，靈敏度達到1×106 CFU/mL，5 min內顯示結果，適合在基層使用。宋佳蕾等[17]針對魚類淋巴囊腫病病原淋巴囊腫病毒（LCDV）膠體金免疫層析試紙條，可在10 min內進行LCDV定性和半定量檢測，并將檢測結果與斑點免疫印跡法、ELISA檢測進行對比，論證高靈敏性的GICA在現場快速檢測的實用性。

1.2.2 ? ?在藥物殘留的快速檢測方面。逐步對GICA檢測方法進行規范化，2017年國家食藥總局發布了利用GICA對水產中孔雀石綠（KJ201701）、硝基呋喃類代謝物（KJ201705）等藥物殘留的快速檢測方法公告，對相關檢測方法給予認可并加以規范[18]。廣東省于2016年7月至2019年6月3年間，利用GICA檢測方法共檢測孔雀石綠項目42 458批次，檢出不合格449批次，通過加標盲樣測試和高效液相色譜-質譜串聯LC-MS驗證，證實該方法檢出限、假陽性率和假陰性率均達到國家規定標準[19]。宗婧婧等[20]對我國嚴格規定水產中殘留限量的15種喹諾酮類藥物（QNs）建立了GICA快速檢測方法，可在3～5 min之內獲得和超高效液相色譜-串聯質譜法（UHPLC-MS/MS）一致的檢測結果，15種喹諾酮類藥物的檢出限在0.3～5 μg/kg之間，是一種可廣泛用于檢測機構和水產企業的日常檢驗監測。但在水產毒素的快速檢測方面，主要利用GICA快速簡便的特點，對利用普通方法難以現場快速檢測的水產毒素進行篩查和識別。早在2011年，Komano 等[21]就設計完成蛤蚌毒素GICA快速方法，其最低檢出限為12 ng/mL。張世偉等[22]針對亞洲國家食用河豚的飲食習慣，建立了河鲀毒素GICA檢測方法，只需10 min就可對熱加工河豚產品中的毒素殘存情況進行檢測，最低檢出限為20 μg/kg，為河鲀餐前快檢提供了有力的技術手段。李晨望[23]利用膠體金-納米二氧化硅（CNPs-SNRs）復合材料建立腹瀉性貝類毒素GICA檢測方法，檢測限可達到15.5 ng/mL，方法特異性高、受干擾少，適于水產銷售現場的快速篩查。

1.3 ? ?GICA在乳制品現場快速檢測的應用

GICA在乳制品中的現場快速檢測應用主要集中在藥物殘留、非法添加物以及摻假判別等方面。袁曉春[24]、趙福民等[25]、武晉孝等[26]利用GICA建立針對乳制品中殘留的氨基糖苷類、大環內酯類和林可胺類抗生素的現場快速檢測方法，通過液相色譜法及液相色譜-串聯質譜法進行結果比對，證實了GICA方法在現場快速檢測乳制品抗生素殘留問題的有效性和適應性。白 ?宇等[27]針對乳制品中易濫用易殘留的激素類藥物雌二醇（E2）建立了快速、敏感、特異的GICA方法，通過對該方法的靈敏度、特異性、重復性和加速保存等參數以及交叉反應和干擾反應測定，證實了該方法的有效性。針對乳制品中非法添加三聚氰胺的問題，從嘗試利用GICA方法進行三聚氰胺的篩查[28]到利用GICA高靈敏度快速檢測[29-31]，GICA方法一直是現場快速檢測乳制品中三聚氰胺的最佳選擇。

2 ? ?GICA在植物源性食品現場快速檢測中的應用

2.1 ? ?GICA在糧油安全問題現場快速檢測中的應用

GICA在糧油安全問題現場快速檢測中的應用主要集中在糧油及其制品中常見的真菌毒素、重金屬及致癌物這幾個方面。

2.1.1 ? ?在糧油中常見的真菌毒素檢測方面。利用GICA技術進行定性定量檢測是目前現場快速檢測過程中最常見也是最流行的檢測方法。糧油中黃曲霉毒素的GICA檢測已經是非常成熟的檢測技術，被廣泛應用于糧油安全監測過程中[1-2]。近年來，針對黃曲霉毒素的GICA檢測類型逐漸從大批量定性篩查向準確定性及定量檢測發展。徐振斌等[32]建立了定量檢測玉米中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量的GICA檢測法，檢測限為1.0 μg/kg，定量限為3.0 μg/kg，能夠滿足基本檢測要求。劉 ?靜等[33]借助膠體金讀取儀建立了高靈敏的定量檢測黃曲霉毒素B1的GICA檢測法，靈敏度為5.7 ng/L，能夠滿足實際工作中食品檢測需求。糧油中常見的赭曲霉毒素[34]、玉米赤霉烯酮[35]、伏馬菌素[36]等都是近年來GICA檢測應用的主要對象。

2.1.2 ? ?在糧油的重金屬及致癌物檢測方面。GICA技術利用簡單便捷的特點可彌補傳統檢測方法對儀器及操作要求高不適應現場快速檢測的問題。王 ?森等[37]采用免疫競爭法研制靈敏度1 μg/L、操作過程3～5 min、可用于快速檢測重金屬汞殘留的膠體金免疫層析測試卡。劉美辰等[38]建立了快速定量檢測糙米中重金屬離子鉛的膠體金免疫層析試紙條分析方法，檢出限為0.041 mg/kg，定量限為0.097 mg/kg，與原子吸收光譜法檢測結果一致。劉 ?波等[39]建立了快速檢測食用油中致癌物苯并芘的膠體金免疫層析試紙條方法，檢測限可達5～10 ng/mL，且與大部分苯并芘結構類似物無交叉反應。

2.2 ? ?GICA在果蔬安全問題現場快速檢測的應用

GICA在果蔬安全問題現場快速檢測的應用主要集中在果蔬農藥殘留檢測方面。GICA技術能夠解決基層果蔬農殘大批量檢測問題，又能夠彌補農殘速測卡法容易受環境影響出現假陽性等問題。早在2009年，機磷農藥的膠體金免疫層析快速檢測試紙條就已經被研發[40]，隨著研究的深入，在檢測時間、檢測靈敏度等方面不斷完善GICA技術在果蔬農殘中的應用。按照《農殘辦技術材料要求及審查程序》要求，朱亮亮等[41]研制出針對辛硫磷、對硫磷、丙溴磷、氯唑磷等4種有機磷農藥的膠體金免疫層析測試條，檢測限均為200 μg/kg，檢測時間僅僅為15 min，假陽性率和假陰性率均為0，適合應用到基層大批量樣本檢測中。許俊麗等[42]建立了戊唑醇免疫層析快速檢測方法，可以在15 min內實現小麥、黃瓜和甘藍中戊唑醇定性與半定量分析，最低檢測限為6.25 ng/mL，分析結果與高效液相色譜質譜聯用（LC-MS/MS）方法的檢測結果一致，可以滿足現場快速篩查大量樣品的需求。

3 ? ?展望

膠體金免疫層析技術以其生產成本低、操作簡單、檢測快速、靈敏度高、特異性強、肉眼易判斷、技術操作要求低等優點被廣泛應用于食品安全現場快速檢測中，備受基層監管部門和中小型食品企業的歡迎。有效提高免疫標記技術的敏感性、特異性，并實現高通量檢測、定量或半定量檢測，不斷擴大膠體金免疫層析技術的應用廣度和深度是該技術應用發展的主要趨勢。同時，進一步降低膠體金免疫層析檢測產品的價格，全面推廣普及膠體金免疫層析技術的應用，對于在全國范圍內加強食品安全基層監管、提升中小企業自檢效率、提高民眾食品安全意識具有重要的經濟價值和社會價值[43-45]。

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