內(nèi)生菌醇提取物對(duì)雞冠花生長與抗逆性的影響

陳利云，呼麗萍，汪之波

(天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院/甘肅省大櫻桃工程技術(shù)研究中心，甘肅 天水 741000)

天然無污染微生物菌肥能提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，增強(qiáng)作物的抗逆性，是發(fā)展綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要途徑。植物內(nèi)生菌(endophytic fungi)是一類生活在活體植物組織內(nèi)的微生物菌體，具有不同生存策略，與宿主共生的內(nèi)生菌不會(huì)引發(fā)植物產(chǎn)生明顯病害癥狀[1]。1993年Stierle從短葉紅豆杉(TaxusbrevifoliaNutt)內(nèi)生菌中分離出抗癌藥物紫杉醇，推動(dòng)了從植物內(nèi)生菌中尋求活性生物活性代謝物的研究[2]，在真菌、細(xì)菌和放線菌中，植物內(nèi)生真菌是目前研究的熱點(diǎn)[3-5]，它們代謝產(chǎn)生的酚類物質(zhì)、抗氧化活性物質(zhì)、生物堿等物質(zhì)能促進(jìn)宿主植物的生長并增強(qiáng)植物抗逆性[6-7]。銀杏(GinkgobilobaL.)是被稱為“活化石”的裸子植物，在地球上已有約3億年的演化歷史，是銀杏屬唯一的現(xiàn)存種，也是我國特有的世界珍稀樹種，內(nèi)共生理論學(xué)說認(rèn)為，在長期的進(jìn)化歷程中，銀杏幾乎不被病蟲害感染的原因與其體內(nèi)協(xié)同進(jìn)化的多樣性內(nèi)生菌密不可分，而這些內(nèi)生菌代謝產(chǎn)生高活性的抑菌物質(zhì)，為此樹種成為自然進(jìn)化史中的活化石提供了保障[8-10]。本研究前期試驗(yàn)從銀杏葉片中分離篩選了大量內(nèi)生真菌，用這些內(nèi)生真菌醇提取物處理鳳尾雞冠花，以探究不同的內(nèi)生菌醇提取物對(duì)鳳尾雞冠花生長發(fā)育及抗逆性的影響，為深入解析內(nèi)生真菌與宿主植物間的共生關(guān)系的分子機(jī)理，研制無污染、綠色、環(huán)保的生物制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試鳳尾雞冠花：鳳尾雞冠花(CwlosiaargenteaL. cv.plumosa)，購買于北京金地永豐農(nóng)業(yè)科技有限公司。供試內(nèi)生真菌分離于天水地區(qū)本土銀杏鮮葉(保存于天水師范學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。

內(nèi)生菌醇提取物：編號(hào)為Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ的內(nèi)生菌醇提取物分別提取于編號(hào)為1、3、6的銀杏內(nèi)生真菌，分屬于晶粒鬼傘種(Coprinusmicaceus)、鏈格孢屬(Alternariasp.)、鏈格孢種(Alternariaalternate)，提取方法是在參考Wu等[11]方法的基礎(chǔ)上做了優(yōu)化。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

種子處理：供試的鳳尾雞冠花種子用10%的巴氏消毒液處理15～20 min，再用單蒸水清洗4～5次，分別用1 ng/mL內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ浸泡12 h，設(shè)置超純水浸種為對(duì)照，之后將種子移入MS培養(yǎng)液中發(fā)芽培養(yǎng)7～10 d，備用。

盆栽試驗(yàn)：培養(yǎng)盆(直徑28 cm、高30 cm)裝入同等質(zhì)量的基質(zhì)(沙、草炭、有機(jī)肥體積比為4∶1∶2)，種植以上處理過的種子，每處理3次重復(fù)，分甲乙2組溫室培養(yǎng)，甲組植株長出2片子葉后(10 d)每5 d用100 mL 0.1 ng/mL的內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ葉面噴灑處理組，培養(yǎng)30 d。

干旱試驗(yàn)：乙組植株長出2片子葉后(10 d)用濃度為0、30%的聚乙二醇(PEG-6000)溶液葉面噴灑做干旱脅迫處理，20 d后進(jìn)行形態(tài)和生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

電子天平測(cè)定每盆植株鮮重，葉片面積用便攜式葉面積測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，花色素的測(cè)定采用液質(zhì)聯(lián)用法分光光度法測(cè)定。抗病力檢測(cè)采用西瓜殼二孢-甜瓜蔓枯病(AscochytaCitullinaSmith)病原真菌感染葉片，臺(tái)盼藍(lán)(Typan blue)染色程度的量化分析。葉綠素采用比色法測(cè)定，脯氨酸采用茚三酮顯色比色法測(cè)定，丙二醛采用紫外分光光度法測(cè)定，可溶性糖采用蒽酮比色法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007、SPSS 11軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、整理、分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌醇提取物Ⅲ對(duì)鳳尾雞冠花生長發(fā)育的影響

內(nèi)生菌醇提取物Ⅲ能促進(jìn)鳳尾雞冠花地上植株的生長(圖1)，與對(duì)照相比，植株莖稈明顯粗壯，單株鮮重是對(duì)照的3.87倍，同時(shí)葉片面積明顯增大，比未處理的對(duì)照增加了83%，呈顯著差異。鳳尾雞冠花表型特性表明：內(nèi)生菌醇提取物Ⅲ能促進(jìn)雞冠花莖、葉等器官變大，對(duì)鳳尾雞冠花的生長發(fā)育具有明顯的促進(jìn)作用。

2.2 內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ對(duì)鳳尾雞冠花耐旱性的影響

花青素含量是衡量植物耐旱能力的主要指標(biāo)，對(duì)鳳尾雞冠花進(jìn)行干旱脅迫培養(yǎng)顯示，內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ處理的雞冠花耐旱性明顯提高(圖2)。與對(duì)照相比植株成活率為增加了4.97倍。干旱脅迫比較敏感的植物花青素合成較快，未經(jīng)內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ處理的鳳尾雞冠花花青素含量明顯比處理過的高，為處理的2.7倍。

2.3 內(nèi)生菌醇提取物Ⅵ鳳尾雞冠花抗病力的影響

內(nèi)生菌醇提取物Ⅵ能增強(qiáng)抗病能力(圖3)，將內(nèi)生菌醇Ⅵ處理過的種子播種培養(yǎng)15 d后，葉片用西瓜殼二孢-甜瓜蔓枯病病原真菌感染，通過對(duì)臺(tái)盼藍(lán)染色程度的量化分析顯示，與對(duì)照相比內(nèi)生菌醇提取物Ⅵ處理過的雞冠花死亡細(xì)胞數(shù)目顯著降低，是對(duì)照的44%，試驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)生菌醇提取物Ⅵ能明顯提高鳳尾雞冠花對(duì)蔓枯病病原菌的抵抗力。

A.內(nèi)生菌醇Ⅰ處理干旱脅迫盆栽30 d的鳳尾雞冠花植株；B.未處理對(duì)照播種后30 d葉片上花青素。圖2 內(nèi)生菌醇Ⅰ對(duì)鳳尾雞冠花花青素含量的影響

A.用內(nèi)生菌醇Ⅵ處理盆栽15 d后的鳳尾雞冠花植株；B.Ⅵ未處理的盆栽15 d植株。圖3 內(nèi)生菌醇Ⅵ對(duì)鳳尾雞冠花抗病力的影響

2.4 內(nèi)生菌醇提取物對(duì)鳳尾雞冠花可溶性糖、葉綠素等物含量的影響

對(duì)由內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ處理及對(duì)照培養(yǎng)30 d后的葉綠素、脯氨酸、丙二醛及葡萄糖含量檢測(cè)顯示，植株可溶性糖含量隨著干旱脅迫程度的加強(qiáng)而增強(qiáng)(圖4)，但其他幾種活性物質(zhì)含量與對(duì)照間無顯著差異，內(nèi)生菌醇提取物Ⅲ、Ⅵ對(duì)植株抗旱性無明顯影響，而內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ能顯著提高鳳尾雞冠花對(duì)干旱脅迫的抵抗力。

圖4 內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ對(duì)鳳尾雞冠花葉綠素、脯氨酸、丙二醛及葡萄糖含量的影響

3 討論

共生在宿主組織中的內(nèi)生真菌能促進(jìn)宿主植物生長發(fā)育，它們能代謝產(chǎn)生生長素、赤霉素等植物激素，能加強(qiáng)宿主的生物固氮效率，增強(qiáng)宿主對(duì)礦物質(zhì)營養(yǎng)元素如氮、磷、鉀的吸收，從而促進(jìn)宿主種子萌發(fā)率，提高幼苗存活、增加分蘗生長[12-15]。通過與宿主長期的協(xié)同進(jìn)化，內(nèi)生菌能產(chǎn)生與宿主植物相似或相同的活性化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)大多能促進(jìn)植物生長發(fā)育并提高宿主植物對(duì)生物和非生物脅迫的抵抗力[16-17]。易婷等[18]研究發(fā)現(xiàn)，向日葵根部分離出的根瘤菌可通過分泌胞外多糖改變土壤結(jié)構(gòu)增加植物根部對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，從而促進(jìn)向日葵的生長。內(nèi)生菌醇提取物Ⅲ誘導(dǎo)鳳尾雞冠花葉片面積增大和生物量的增加很可能是通過活性物質(zhì)改變根部土壤環(huán)境從而緩解了植物根部的非生物壓力來實(shí)現(xiàn)的。

內(nèi)生真菌在宿主細(xì)胞中的定殖、孢子萌發(fā)、菌體生長繁殖以及物質(zhì)代謝過程都要受宿主植物表現(xiàn)型和基因型的影響，這種基因?qū)用娴慕换プ饔卯a(chǎn)生的信息傳導(dǎo)通路，使內(nèi)生菌參與到宿主次生代謝產(chǎn)物合成的過程中，在其中起到協(xié)同或催化關(guān)鍵酶類合成的作用[19-20]，直接或間接地影響宿主植物的生長發(fā)育、抗逆性及生殖等過程，提高宿主植物在惡劣、貧瘠環(huán)境中的生存力[21]。內(nèi)生菌醇Ⅵ處理能增強(qiáng)雞冠花對(duì)西瓜殼二孢-甜瓜蔓枯病病原真菌侵染的抵抗力，降低葉片細(xì)胞死亡數(shù)目。內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ處理時(shí)鳳尾雞冠花可溶性糖含量隨著干旱脅迫程度的增大而增加，這與Yu等[22]的研究結(jié)果一致，推測(cè)此種變化很可能是由內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ處理后，鳳尾雞冠花對(duì)糖信號(hào)感知能力發(fā)生變化引起的。

在植物體內(nèi)，調(diào)控植物生長發(fā)育、脅迫、代謝等途徑的信號(hào)通常是一致的，這都是生物進(jìn)化的結(jié)果[23-24]。解析糖信號(hào)介導(dǎo)的內(nèi)生菌提取物誘導(dǎo)雞冠花高產(chǎn)抗逆性的分子機(jī)制，能為未來研發(fā)更高效的微生物肥料提供理論支柱和基本思路，但內(nèi)生菌醇提取物Ⅰ、Ⅲ和Ⅵ是否誘導(dǎo)了糖信號(hào)異常？這些糖信號(hào)的受體是什么是以什么方式作用等問題還需進(jìn)一步深入探討。