許昌煙草根腐病的分子鑒定及致病性分析

姚 健，劉玉珍，李建華，王 京，孫曉偉，李肖宇，法鵬飛，危月輝*

(1.河南省煙草公司 許昌市公司，河南 許昌 461000； 2.福建三炬生物科技股份有限公司，福建 廈門 361001； 3.福建省生物肥料企業(yè) 工程技術研究中心，福建 廈門 361001)

煙草屬茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotianna)紅花煙草種(N.tabacum)，是一年或多年生草本植物，是我國一類重要的經濟作物。作為卷煙的主要原料，其品質與產量卻常年遭受病蟲害這一因子的制約[1]。根據(jù)現(xiàn)有研究表明，煙草病蟲害的發(fā)生與傳播，將直接導致其產量損失達到10%～15%。根據(jù)調查研究結果表明，煙草病害種類非常多，全世界范圍內至少可以達到100多種，在我國目前已經發(fā)現(xiàn)的具有侵染性的病害就已經達到了60多種，其中引起根莖類病害的主要有煙草疫霉黑脛病、根串珠霉根黑腐病、鐮刀菌根腐病、青枯病以及猝倒病等[2-3]。

由鐮刀菌病原菌侵染煙草根部引起的根腐病是世界性的土傳性真菌病害，普遍存在于我國云南、河南、福建、貴州、四川等煙草主要產地，這不僅制約了我國煙草產業(yè)的快速發(fā)展，同時也造成了巨大的經濟損失。由于煙草根腐病常常會與煙草黑脛病、青枯病或其他根莖部的病害一起發(fā)生，造成生產上準確診斷該病害存在困難，因此，確定當?shù)匾鸢l(fā)病的病原菌種類及其致病力的強弱是指導煙草根腐病防治的基礎[4]。以往單純依靠形態(tài)特征不能解決許多植物病原菌種類分類地位的問題，近年來，依據(jù)形態(tài)學特征結合分子生物學分析，解決了包括煙草等很多此類問題[5]。目前主要使用化學藥劑來防治煙草根部類病害，但在生產實踐中發(fā)現(xiàn)，只采用一種方法是很難達到防治該病害的效果，需要采用多種手段一起進行防治，科學協(xié)調農業(yè)防治、化學防治和生物防治有效措施，這樣才能經濟、有效地進行煙草根莖病害的防治[6]。

河南省許昌煙區(qū)屬于傳統(tǒng)煙區(qū)，常年的煙草種植，使煙區(qū)很多地方根部類病害不斷擴散，嚴重影響了煙草產量和質量，因此我們應該十分重視該類病害，并采取相應的有效防治措施來避免或者減少該類病害的暴發(fā)[7]。目前，已有研究報道河南省的煙草根腐病現(xiàn)狀，但關于引起該類病害的病原菌種類，以及不同煙草種植區(qū)域病原菌致病力的差異和該病原菌侵染煙草根部引起的病害等都缺乏系統(tǒng)性的研究。因此，本研究以許昌煙區(qū)發(fā)病的煙株以及根際土壤為研究材料，從中分離純化出疑似煙草鐮刀菌病原菌，并對其進行形態(tài)學鑒定、rDNA-ITS序列測定及分析、致病性強弱測定，初步確定引起許昌煙草根腐病的鐮刀菌種類，以期為許昌煙草根腐病的判斷與有效防治提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2018年煙草主要病害發(fā)生季節(jié)，從許昌市各煙區(qū)(禹州范坡、許昌縣、襄縣王洛等)，采集具有典型根腐病癥狀的根部以及土壤，用無菌塑料袋將其分裝帶回實驗室，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 分離培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、氯霉素0.1 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1000 mL，自然pH值。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌分離 在煙草發(fā)病田采集煙草病株，并對其進行分類。對于具有明顯病癥的根和莖，可直接挑取其菌絲體、子實體、霉狀物或菌核等，在無菌環(huán)境下接種至提前配置好的PDA培養(yǎng)基上，重復做2～3個平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d；對于沒有明顯病癥的根和莖，采用組織分離法對病原菌進行分離，在簡易條件下營造潔凈的工作環(huán)境，利用酒精燈火焰滅菌然后形成一個無菌的小環(huán)境，剖開煙草新鮮發(fā)病的莖稈，用鑷子取病莖內碟片狀的病髓片，置于預先制備好的固體培養(yǎng)基上，每個平板接2～4個病髓片，做2～3個平行，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。定期觀察平板上的菌落生長狀態(tài)，從中挑取單一的菌落進行分離純化培養(yǎng)，觀察和記錄菌落特征，并挑取菌絲體，制作成切片，進行鏡檢并拍照，最后將分離純化后的單一菌株轉接到提前配置好的PDA試管斜面培養(yǎng)基上，置于4 ℃冰箱中保存[8-9]。

1.3.2 煙草根際土壤病原菌的分離 稱取煙草病株根際土樣10 g，裝進加有100 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，將錐形瓶置于220 r/min的振蕩器上振蕩5 min；配置成稀釋度為10-1～10-6的根際土壤懸液，分別吸取10-4～10-6不同稀釋度的土壤懸液100 μL，用涂布棒均勻涂布到PDA培養(yǎng)基固體平板上，每個稀釋度涂布2～3個平板，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長情況，挑出其中的單菌落繼續(xù)進行純化培養(yǎng)，觀察和記錄菌落特征，然后挑取菌絲體、子實體等，制作成切片，進行鏡檢并拍照記錄，最后將分離純化后的單一菌株轉接到提前配置好的PDA試管斜面培養(yǎng)基上，待菌絲體長滿斜面后置于4 ℃冰箱中保存[10]。

1.3.3 病原菌的分子鑒定 在形態(tài)學特征和生理生化鑒定的基礎上，利用rDNA-ITS分子生物學技術進一步鑒定該病原菌。挑取分離純化得到的可能為根腐病病原菌的菌株，采用CTAB法提取病原菌的基因組DNA，并用PCR特異性引物進行擴增，PCR擴增引物、反應體系及擴增程序參見文獻[11]。將具有特異性條帶的擴增產物送至廣州睿博興科進行rDNA-ITS測序，測得的序列與GenBank中的相關數(shù)據(jù)進行Blast相似性分析[12]。

1.3.4 病原菌致病性的測定 煙苗在福建三炬生物科技股份有限公司研究院實驗室培育至4葉期。將分離獲得的純培養(yǎng)菌株接種到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、200 r/min恒溫振蕩器上振蕩培養(yǎng)5～7 d，用無菌水將病原菌培養(yǎng)液制備成濃度為106～107個/mL的孢子懸液，備用。挑取肉眼看起來健康并長勢大概一致的煙苗進行灌根接種，每株煙苗灌10 mL孢子懸液，每個處理5株煙苗，每個處理重復3次，將灌10 mL清水的煙苗作為對照，置于25～28 ℃溫室中培養(yǎng)，接種2周后開始定期觀察并記錄煙苗的發(fā)病情況。采用組織塊分離法、劃線分離法對發(fā)病煙苗重新進行分離，并鏡檢觀察分離物與接種物是否一致[13-14]。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離結果

采用培養(yǎng)真菌用的PDA培養(yǎng)基對煙草病原菌進行分離，挑取單菌落進行平板劃線進行多次分離純化，記錄單菌落的形態(tài)特征，并對其進行編號，轉接至斜面培養(yǎng)基上保存(表1)。從4個地區(qū)采集的樣品中共分離得到38株菌株，經過形態(tài)觀察和鏡檢，其中10株菌株可能為根腐病病原菌，分別為W1J-2、W1T-3、W2G-2、XG-1、W2T-3、XJ-2、YJ-6、XG-2、XJ-1、W1G-2(圖1)。

表1 部分菌株的形態(tài)特征

圖1 菌株YJ-6和XG-1的菌落形態(tài)和鏡檢結果

2.2 病原菌的鑒定結果

通過對菌株進行分子生物學鑒定，對測序獲得的rDNA-ITS基因序列進行BLAST分析，各病原菌與系統(tǒng)發(fā)育關系最近種屬的菌株rDNA-ITS基因相似性如表2所示。從表2可知，煙草病原菌rDNA-ITS基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的相關菌株rDNA-ITS基因序列的相似性均達到99.21%以上，菌株YG-1、W2G-2、XG-1、YJ-6、XJ-2、W1J-22與尖孢鐮刀菌的相似性達到99.52%以上，由此可初步說明煙草的優(yōu)勢病原菌歸屬于鐮刀菌屬。由于分子鑒定的結果與形態(tài)學鑒定的結果一致，從而可以初步判定引起許昌煙草根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌。

2.3 病原菌致病性分析

分離、純化得到的病原菌主要是腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌2種，為進一步確定其致病性強弱，采用傷根接種法進行病原菌的致病性測定。試驗結果顯示，在健康而且長勢一致的煙草幼苗上分別接種腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和無菌水(對照)，14 d后，接種尖孢鐮刀菌的煙草幼苗呈現(xiàn)萎蔫癥狀，拔出煙草幼苗，其近地面的莖部已變?yōu)楹诤稚米詠硭畬l(fā)病的煙苗沖洗干凈后發(fā)現(xiàn)它的根部全部發(fā)病，主根根部出現(xiàn)黑褐色病斑，表現(xiàn)最為嚴重的植株，其主根腐爛引起植株枯死；接種腐皮鐮刀菌的煙草幼苗，呈現(xiàn)輕度的萎蔫癥狀，在近地面的病健交界處會長出新根，以維持其自身生長；接種無菌水的煙草幼苗長勢良好，植株未出現(xiàn)萎蔫癥狀，根系生長旺盛，根部沒有出現(xiàn)腐爛癥狀。采用組織塊分離法、劃線分離法對病株上的病原物進行分離，發(fā)現(xiàn)分離純化后得到的病原菌與接種的病原菌形態(tài)特征相同，由此證明，分離純化出來的病原菌是引起煙草根腐病的病原菌。從致病性結果總結得出，可進一步確定煙草根腐病主要致病菌為尖孢鐮刀菌。

表2 煙草病原菌與相關菌株的rDNA-ITS基因序列相似性

圖2 接種無菌水和煙草病原菌的癥狀

3 結論與討論

本研究通過對從發(fā)病煙草根部分離得到煙草根腐病病原菌菌株的形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，并結合致病性測定的結果，造成根腐病的病原物主要是腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌屬的真菌，尖孢鐮刀菌為主要致病菌，這一試驗結果與陳高航[9]研究認為的煙草根腐病的優(yōu)勢病原菌為尖孢鐮刀菌的結論是一致，但與吳安忠等[15]研究認為的共享鐮刀菌是煙草根腐病的優(yōu)勢病原菌結論不一致，這可能與不同地區(qū)、不同品種的煙草有關[16-17]。

鐮刀菌屬于真菌，其數(shù)量、種類非常龐大，而且隨著環(huán)境的改變，變異的頻率非常高，因此，只依靠傳統(tǒng)的單一的形態(tài)學鑒定方法對鐮刀菌進行分離、純化、鑒定，很難準確地確定該病原菌的分類地位。隨著分子生物學、高通量測序和基因工程等技術的快速發(fā)展，研究學者們已經研究發(fā)現(xiàn)真菌的rDNA-ITS區(qū)的基因序列比較穩(wěn)定[18]，我們可以利用真菌的這個特點，從現(xiàn)代分子生物學的角度對鐮刀菌進行屬及種水平上的分類鑒定，這樣的話可以在一定程度上減少形態(tài)學鑒定的主觀性。