云南糯玉米地方品種糯性等位基因wx-xuanwei的分子特征

武曉陽，隆文杰，陳 丹，周國雁，杜 娟，伍少云，蔡 青

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，云南 昆明 650223)

糯玉米起源于中國，所以中國擁有非常豐富多彩的糯玉米地方品種，尤其是中國的西南地區(qū)，如云南及其周邊地區(qū)更是中國糯玉米的起源中心和遺傳多樣性中心[1-4]。糯玉米在云南的4個玉米生態(tài)種植區(qū)，即滇中溫暖、滇西北冷涼、滇南暖熱和滇東北溫涼生態(tài)區(qū)[5]都有分布，農(nóng)家品種數(shù)量眾多，約占收集、保存的云南地方玉米種質(zhì)資源樣品數(shù)的10%以上，達400多份，且類型多樣，籽粒色澤變化豐富。其中滇中和滇南玉米生態(tài)區(qū)是云南糯玉米品種多樣性和性狀多樣性的中心。這種多樣性可能與聚居在云南、尤其是南部和西南部多個少數(shù)民族的糯食文化，以及這些地理區(qū)域的特殊生態(tài)、地理和立體農(nóng)業(yè)氣候有一定關(guān)聯(lián)。這些豐富多樣的云南糯玉米地方種質(zhì)資源是開展糯玉米研究的物質(zhì)基礎(chǔ)，深入分析其waxy基因的等位變異類型與組成，發(fā)掘新基因，對針對性保護和利用攜帶珍稀基因的遺傳資源材料具有重要意義和實用價值。糯玉米(ZeamaysL. var.certainKulesh)是在中國境內(nèi)被成功馴化的特殊栽培類型，因其籽粒胚乳淀粉幾乎全部為支鏈淀粉而導(dǎo)致籽粒或淀粉表現(xiàn)為糯性[6-7]或粘性，此糯性受隱性waxy單基因的控制。普通玉米的waxy基因能正常表達GBSSⅠ蛋白并合成直鏈淀粉，而糯玉米因waxy基因突變造成GBSSⅠ蛋白失活、直鏈淀粉合成受阻，便產(chǎn)生糯性籽粒和糯性支鏈淀粉。玉米的waxy基因定位于9號染色體，全長約4.5 kb，包含有14個外顯子[8]。

箭頭表示插入突變，下劃線表示缺失突變。圖1 waxy基因的突變位點

目前，在糯玉米中已發(fā)現(xiàn)超過50種以上的waxy基因突變類型(圖1)，但絕大多數(shù)都是插入或缺失突變，因此玉米waxy基因的等位突變不僅呈現(xiàn)出多樣性，而且插入/缺失突變也是其基因突變的主要形式[9]。在中國糯玉米地方品種中，糯性基因wx-D7和wx-D10是序列缺失造成的突變類型,其中wx-D7是其第7外顯子存在有30 bp的序列缺失，而wx-D10是其第10外顯子有15 bp的序列缺失[10，11]。基因wx-Cin4、wx-124和wx-Reina都發(fā)現(xiàn)存在于云南糯玉米地方種質(zhì)資源中，而且都是由轉(zhuǎn)座子插入造成的突變類型，其中，wx-Cin4是由一個466 bp的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Cin4插入waxy基因的第6外顯子當(dāng)中造成的插入突變，wx-124是由一個116 bp的MITE(Miniature Inverted-repeat Transposable Element)類轉(zhuǎn)座子“124”插入waxy基因的第7外顯子當(dāng)中造成的插入突變，wx-Reina則是在waxy基因的第10內(nèi)含子中插入了一個約5.4 kb的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Reina[12，13]。在我們前期研究中，雖然現(xiàn)在已基本明確，在大量豐富的云南糯玉米地方種質(zhì)資源中，基因wx-D10和wx-Reina有相當(dāng)高的分布頻率，分別有約50%和 30%的云南糯玉米地方種質(zhì)資源攜帶有這兩個基因，是云南糯玉米地方種質(zhì)資源的糯性優(yōu)勢基因或高頻率基因。同時，基因wx-D7、wx-Cin4和wx-124在云南糯玉米地方種質(zhì)資源當(dāng)中出現(xiàn)的頻率相當(dāng)?shù)停辉谏贁?shù)或個別云南地方糯玉米品種中存在，是稀有基因或低頻基因。然而，除已明確攜帶有上述5個waxy基因的材料外，還有約占云南糯玉米地方品種數(shù)1/5的100份左右材料帶有未知的waxy基因。因此，深入分析這些資源的waxy基因突變類型及其分子特征，有助于了解和掌握整個云南糯玉米地方品種的waxy基因構(gòu)成、分布，探討云南糯玉米waxy基因與生態(tài)地理、立體農(nóng)業(yè)氣候和民族飲食文化之間的協(xié)同進化關(guān)系。本文通過現(xiàn)代分子生物學(xué)方法的克隆、測序等手段，研究分析了攜帶未知糯性基因的云南糯玉米地方種質(zhì)資源waxy基因的突變形式及其分子特征，以期發(fā)掘新基因，為有針對性地保護和利用具稀有或低頻基因的種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

含未知waxy等位基因的云南糯玉米地方品種共10份(表1)及對照材料普通(非糯)玉米自交系B73，取自國家科技資源共享服務(wù)平臺—國家作物種質(zhì)資源庫(云南)暨 “云南省作物種質(zhì)資源保存庫”。10份實驗材料涵蓋滇南(元江縣、瀾滄縣、廣南縣和元陽縣)、滇中(宜良縣、保山市隆陽區(qū)、雙柏縣)、滇西北(瀘水縣、華坪縣)和滇東北(宣威市)4個云南玉米的生態(tài)區(qū)。

表1 實驗材料的信息

1.2 突變點的發(fā)現(xiàn)

為檢測帶有未知糯性基因的云南糯玉米地方品種的waxy基因突變位點，首先從幼葉提取實驗材料的基因組DNA[15]，然后用可以覆蓋整個waxy基因的11對分子標記(表2)來檢測10份實驗材料的基因組DNA。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括1×PCR buffer、1 U Taq酶(TaKaRa公司)、0.2 mmol/L的dNTPs、0.4 μmol/L的兩端引物和50 ng的基因組DNA。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃持續(xù)5 min；35個循環(huán)，包括94 ℃持續(xù)1 min、57 ℃持續(xù)1 min和72 ℃持續(xù)1～3 min；最后72 ℃持續(xù)5 min。

1.3 xuanwei的序列測定

染色體步移采用簡化的熱交錯不對稱PCR(Tail-PCR)方法[13]，其擴增過程簡化為兩輪反應(yīng)。第一輪Tail-PCR反應(yīng)使用的引物為上游特異引物和在5′-端增加結(jié)合點的隨機引物。其PCR采用普通PCR反應(yīng)體系，而Tail-PCR反應(yīng)程序為：首先，94 ℃持續(xù)5 min；然后包括94 ℃持續(xù)1 min，58 ℃持續(xù)1 min和72 ℃持續(xù)3 min的5個循環(huán)；接著為94 ℃持續(xù)1 min，且每秒降低0.5 ℃并在30 ℃下持續(xù)1 min，72 ℃持續(xù)3 min；再包括94 ℃持續(xù)1 min，58 ℃持續(xù)1 min，72 ℃持續(xù)3 min，94 ℃持續(xù)1 min，50 ℃持續(xù)1 min和72 ℃持續(xù)3 min的15個循環(huán)；最后72 ℃持續(xù)5 min。第二輪Tail-PCR反應(yīng)使用的引物是下游特異引物和結(jié)合到隨機引物5′-端的引物。反應(yīng)體系仍采用普通PCR反應(yīng)體系，但其模板為第一輪Tail-PCR的產(chǎn)物1 μL，反應(yīng)后的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖檢測，并直接測序。

用已測序的普通玉米自交系B73的基因組序列作為參考序列，以分段式方法克隆大片段xuanwei。分3段完成xuanwei的PCR擴增，其中對前后兩段的擴增使用結(jié)合到waxy基因和xuanwei的引物，所獲得的PCR產(chǎn)物被用于直接測序。中間一段的擴增采用巢式PCR法。其中，第一輪擴增使用結(jié)合到waxy基因序列的引物，而第二輪擴增則以第一輪擴增結(jié)束后的1 μL PCR產(chǎn)物為模板，用結(jié)合到xuanwei的引物來擴增，最終的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖檢測和直接測序。

表2 用于檢測waxy基因外顯子區(qū)域插入片段的引物

1.4 wx-xuanwei的序列分析

利用基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)(Gene Structure Display Server，GSDS)繪制waxy基因結(jié)構(gòu)圖[16]，而用基因組序列ZmB73_AGPv1_genome (http://ftp.maizesequence.org/current/assembly/)建立的本地Blast數(shù)據(jù)庫[17]分析轉(zhuǎn)座子在玉米基因組中的拷貝數(shù)。NCBI中的blast N被用于分析插入片段的類型和參考序列，而blast X和NCBI Conserved Domain Search(CDD)被用于分析轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)域[18]，NCBI中的ORF finder則被用于分析開放閱讀框。軟件CLUSTAL X (1.8)被用于序列比對[19]。Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)被用于引物的在線設(shè)計[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 waxy基因的檢測

為檢測具有未知等位基因的糯玉米資源，本研究開發(fā)了可以檢測整個野生型waxy基因的分子標記(表2)。利用這些分子標記進一步檢測具有未知等位基因的10份糯玉米材料，發(fā)現(xiàn)其中一份材料糯包谷(232248)中在標記waxy-22的PCR擴增區(qū)域，也就是14個外顯子區(qū)域不能有效擴增。初步認為這一區(qū)域存在基因突變。

2.2 突變位點序列的測定

為了測定在宣威糯包谷中發(fā)現(xiàn)的waxy基因第14外顯子突變點的序列，采用簡化Tail-PCR方法進行染色體步移。同時，PCR過程分兩步完成，第一步采用熱交錯PCR預(yù)擴增，第二步則將第一步獲得的PCR產(chǎn)物作為模板進行普通PCR擴增。利用這種方法，獲得了突變位點約700 bp的序列。然后，通過blast N與B73基因組的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)宣威糯包谷waxy基因的突變是由于未命名的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入造成的，因而得到的序列是該轉(zhuǎn)座子的LTR結(jié)構(gòu)的部分序列。因此，宣威糯包谷waxy基因第14外顯子的突變點xuanwei也就是插入片段xuanwei。

利用轉(zhuǎn)座子LTR序列注釋出的B73基因組的同源序列(Chr2：23743198-23748113)作為設(shè)計擴增該突變位點的參考序列，以便對該突變位點作進一步地擴增和測序。由于LTR在玉米基因組中為多拷貝，直接擴增將會影響其擴增的特異性，因此使用waxy基因引物加轉(zhuǎn)座子結(jié)合引物擴增插入片段xuanwei的兩端序列，而xuanwei中間部分的序列則采用巢式PCR擴增。測序并拼接得到的完整的突變位點xuanwei的序列見圖2，為無義鏈序列。為在不同的云南糯玉米地方品種中發(fā)現(xiàn)有效檢測基因wx-xuanwei，并對其開展分布或頻率等深入研究，開發(fā)設(shè)計了1對特異顯性標記。具有wx-xuanwei基因的糯玉米材料能擴增出約100 bp的條帶(圖3)。該特異顯性引物的序列為：F:5′-TTGGCCGACTCTACTGGTTT-3′，R:5′-TTCTCCCAGTTCTTGGCAGT-3′。 F引物結(jié)合位點在轉(zhuǎn)座子的LTR序列上，R引物結(jié)合位點在waxy基因上。

2.3 基因wx-xuanwei的分子特征

云南糯玉米地方品種宣威糯包谷的waxy基因是由反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子xuanwei插入在waxy基因的第14內(nèi)外顯子區(qū)域形成的插入突變基因wx-xuanwei(圖1)，該轉(zhuǎn)座子為完整的LTR轉(zhuǎn)座子，具有5 bp的靶位點重復(fù)序列5′-CTGCC-3′。轉(zhuǎn)座子xuanwei的長度為4893 bp，具有兩個大的開放閱讀框，分別編碼Gag和Pol蛋白，其閱讀方向與waxy基因相反。該轉(zhuǎn)座子的兩端具有序列完全一致的兩個LTR結(jié)構(gòu)，是云南糯玉米地方種質(zhì)資源存在的一個新的插入點。通過結(jié)構(gòu)域CP、INT、RT和RNASE H的順序分析，該轉(zhuǎn)座子屬于Ty1-Copia類的長末端重復(fù)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(圖4)，在玉米基因組中的高倍數(shù)約為2個，是低拷貝類的轉(zhuǎn)座子家族成員之一。目前，在中國糯玉米waxy基因中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)座子均屬于低拷貝家族的成員(表3)。

M為marker，1、2為突變型， 3、4為野生型。圖3 等位基因wx-xuanwei特異分子標記擴增結(jié)果

圖4 等位基因wx-xuanwei的序列及結(jié)構(gòu)特征

3 討論

玉米是原產(chǎn)于美洲[21]大陸的作物，在400～500年前才傳入中國[22]，而且糯玉米是由普通硬粒玉米[23]或爆裂玉米[24]發(fā)生基因突變并被選擇、馴化而來的，已是學(xué)術(shù)界公認的觀點。但是糯玉米在中國的種植歷史有200多年[2,25]。說明玉米在從美洲引入中國后的100～200年時間里就發(fā)生了基因突變，并且這種突變就恰巧被當(dāng)時處在“糯稻栽培區(qū)”或“糯稻文化圈”又或者“糯食文化圈”的中國西南地區(qū)的壯、侗、布依、傣[26]等少數(shù)民族注意到，且把這種突變類型選擇并保留了下來。這些少數(shù)民族是由他們的先人百越人在明、清時期發(fā)展而來的[27]，而百越人是中國最早的稻谷栽培者[28]，當(dāng)然也應(yīng)該是最早的糯稻栽培者和食用者。所以，這些少數(shù)民族也許是從他們的祖先那里學(xué)習(xí)、借鑒了食用、祀用糯稻方面的經(jīng)驗與知識，把與糯稻一樣帶有粘性的糯玉米當(dāng)新鮮食物祭祖、祭神，以及食用等，從而使玉米的糯性突變型糯玉米得以保留、延續(xù)，并積累、形成數(shù)以百計的地方品種或種質(zhì)資源。從這個角度看，中國西南地區(qū)，尤其是云南及周邊地區(qū)的少數(shù)民族的糯食文化與知識是中國糯玉米形成的主要動力。

表3 不同waxy等位基因中轉(zhuǎn)座子在B73基因組中的拷貝數(shù)

DNA序列的缺失和插入是造成玉米waxy基因突變的主要原因，而在插入突變中轉(zhuǎn)座子插入是造成糯性玉米waxy基因突變的一種主要形式[9]。所以，根據(jù)轉(zhuǎn)座子在基因組內(nèi)跳躍的媒介的不同，將其分為DNA轉(zhuǎn)座子和RNA轉(zhuǎn)座子。MITE類型的轉(zhuǎn)座子[22]即屬于DNA轉(zhuǎn)座子。RNA轉(zhuǎn)座子也叫反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，可進一步劃分為長末端重復(fù)(LTR)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和非長末端重復(fù)(Non-LTR)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。長末端重復(fù)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的5′-末端和3′-末端具有長的正向重復(fù)序列，在跳躍過程中LTR序列由同一條DNA模板合成，而隨著時間的推移，其兩端的LTR會發(fā)生一定頻率的突變，使得兩端序列不一致。因此，根據(jù)基因組堿基變化速率可以計算轉(zhuǎn)座子的插入時間[29]。

插入在基因wx-xuanwei中的轉(zhuǎn)座子xuanwei屬于Ty1-Copia[30](表3)，因而基因wx-xuanwei與wx-xuanwei一樣都具有相同的LTR結(jié)構(gòu)，均屬于新的突變位點。但是，與wx-xuanwei不同，wx-Reina在云南糯玉米地方品種或種質(zhì)資源中屬于優(yōu)勢或高頻基因，約30%的云南糯玉米地方品種都帶有該基因，而wx-xuanwei目前只發(fā)現(xiàn)于宣威糯包谷之中，因而與wx-Cin4、wx-124和wx-D7一樣，在云南糯玉米地方品種中都屬于稀有或低頻基因。這些基因在地方品種的傳播過程中更容易丟失，因此在保存過程中值得更加關(guān)注。

4 結(jié)論

wx-xuanwei基因是由反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子或RNA轉(zhuǎn)座子插入玉米waxy基因，在云南糯玉米地方品種中形成的突變型新等位基因和低頻基因。另外9個研究材料的情況依然需要進一步鑒定。