枯草芽孢桿菌液體發酵條件優化探究

徐亞英 黃曉梅 謝麗

摘 要 通過單因素試驗對枯草芽孢桿菌液體發酵培養基及發酵條件進行了優化，為實現該菌株的工業化生產提供數據參考。試驗結果表明：該菌株培養基各組分的最佳配比為蛋白胨1%，麩皮∶酵母提取物（3∶2）為0.5%，氯化鈉1%。最佳發酵培養條件為初始pH值6.0，培養溫度為37 ℃，培養時間為24 h、裝液量100 mL，接種量為4%，轉速為200 rpm·min-1。

關鍵詞 枯草芽孢桿菌;發酵條件;單因子試驗

中圖分類號：S432.2+2 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.20.071

農田中許多病害嚴重發生，化學防治使病原菌的抗藥性增強、不斷分化出新的生理小種，同時造成藥物殘留，對食品安全造成隱患，破壞環境。目前，從微生物代謝物中篩選出防治有害生物的生防農藥成為新農藥研究的重要方向。生物農藥具有高效低毒的優點，越來越受到人類的青睞。

迄今為止，具有生物防治功能的細菌有100多種，我國和世界上許多國家已有商品化微生物農藥產品。但是，多數菌劑在田間應用過程中防效不穩，制約微生物菌劑開發應用。此外，多數研究只是針對某一種病害，具有廣譜抗性的菌株很少。

芽孢桿菌是我國農業部正式批準使用的益生菌，對抗生素無耐藥性，對人畜無毒無害，綠色環保，對環境無污染，對作物安全，可產生多種抗生素，包括脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類等物質，對多種動、植物與人類病原菌具有較好的抑制作用。而且該菌還具有很強的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶活性，并具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。

枯草芽孢桿菌作為有益的根際微生物，越來越得到人們的重視，目前在辣椒、玉米、黃瓜、水稻等農作物的病害上具有較好的生防效果。其芽孢可以制成粉劑、添加劑等各種制劑應用于工農業等各個方面。但是在目前的工業化生產中，常用的發酵方法中存在周期長、芽孢數含量低、成本高等諸多問題。因此，作為微生物制劑，枯草芽孢桿菌發酵工藝的研究對其應用具有非常重要的意義。本試驗通過單因素篩選對該菌株的發酵工藝與條件進行優化，為該菌株生防菌肥的工業化生產提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌由黑龍江農業職業技術學院分析檢測中心微生物實驗室篩選保存。

1.1.2 培養基

種子培養基與基礎發酵培養基均為LB，即蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，自然pH。

1.1.3 試劑

蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、麥芽糖、胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、硫酸鎂、氯化銨、硫酸銨、磷酸二氫鉀、氯化鈉和氯化鈣等，均為分析純試劑。

1.1.4 儀器設備

搖床、天平、高壓蒸氣滅菌鍋、無菌操作臺、pH計及紫外-可見分光光度計等。

1.2 方法

1.2.1 培養的方法

1.2.1.1菌種的活化

將已保存的菌種轉接至LB固體培養基中，37 ℃靜止培養24 h后待用。

1.2.1.2種子液制備

挑取活化的菌株單菌落于含50 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，160 rpm·min-1，37 ℃搖床振蕩16～18 h后待用。

1.2.1.3搖瓶的培養

分別取一定量的種子液，按2%的比例接入含30 mL發酵培養基的三角瓶中，然后置于37 ℃的搖床中，振蕩培養24 h，轉速為200 rpm·min-1，以進行單因素發酵條件研究。

1.2.2 培養基配方的單因素篩選試驗

1.2.2.1碳源

分別用5 g·L-1的葡萄糖、酵母粉、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、麩皮、麩皮∶酵母粉（1∶4）、麩皮∶酵母粉（2∶3）、麩皮∶酵母粉（3∶2）、麩皮∶酵母粉（4∶1）替換基礎培養基的碳源。利用搖瓶發酵的培養條件，24 h后測定發酵液的活菌數，以確定最佳的碳源。

1.2.2.2氮源

分別用10 g·L-1的蛋白胨、硫酸銨、牛肉膏、尿素、硝酸銨、氯化銨、豆粉代替基礎發酵培養基的氮源。利用搖瓶發酵的培養條件，24 h后測定發酵液的活菌數，以確定最佳的氮源。

1.2.2.3無機鹽

分別以5 g·L-1麩皮∶酵母粉（3∶2）和10 g·L-1蛋白胨為碳源和氮源，在此基礎上分別加入10 g·L-1的NaCl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KCl替代等

量的基礎發酵液的無機鹽。采用搖瓶發酵的培養條件，24 h后測定發酵液的活菌數以確定最佳的無機鹽。

每個處理三次重復，其他發酵條件與測定方法同“1.2.1.3”。

1.2.3 發酵條件的篩選

利用篩選出的最適培養基配方，固定搖瓶培養的其他發酵條件，分別對初始pH、裝液量、溫度、接種量、發酵時間與轉速進行優化，如表1所示。

以上試驗均設置3次重復。

1.2.4 測定方法

菌體生長曲線的測定采用OD600 nm值（下同）比濁法。取發酵液10～15 mL在2 000 rpm·min-1下離心2 min，測定菌液的OD600 nm值;pH測定儀測定菌液pH。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基優化

2.1.1 碳源

用不同碳源進行篩選試驗，其他組分都相同進行發酵。用比濁法測定其發酵液的OD600 nm值可知，酵母提取物作為碳源時枯草芽孢桿菌的生長明顯優于其他碳源，其次是麩皮，如圖1所示。

考慮到以后工業發酵的成本，本研究又將麩皮與酵母提取物按1∶4、2∶3、3∶2、4∶1的比例分別作為碳源進行試驗，結果表明，麩皮與酵母提取物按不同比例混合作為碳源時仍能滿足生產需要，如圖2所示。麩皮∶酵母粉（3∶2）為枯草芽孢桿菌生長的最佳碳源。

2.1.2 氮源

選用7種不同的氮源培養基，從試驗結果可以看出，以蛋白胨為唯一氮源時該菌的生長能力最強，其發酵菌液OD600 nm值最高，其次是牛肉膏，如圖3所示，說明枯草芽孢桿菌生長的最適氮源是蛋白胨。

2.1.3 無機鹽

2.2 發酵條件實驗

2.2.1 初始pH

將初始pH分別調至不同的pH值，在搖瓶發酵培養條件下培養24 h。如圖5所示，初始pH值為6.0時發酵液的OD600 nm值最大，當發酵液的初始pH>6.0時，發酵液OD600 nm值開始逐漸下降。所以，枯草芽孢桿菌液體發酵的最適初始pH值為6.0左右。

2.2.2 接種量

對不同接種量進行篩選，在搖瓶發酵培養條件下培養24 h，設初始pH值為6.0。通過實驗可知，枯草芽孢桿菌培養的最適接種量為4%，在接種量為1%～4%時，隨接種量增加，發酵液的OD600 nm值略有升高。接種量大于4%時，枯草芽孢桿菌發酵液OD600 nm值開始下降

2.2.3 裝液量

在搖瓶發酵的培養條件下培養24 h，設初始pH值為6.0，接種量為4%。由圖7可知，通過對發酵液OD600 nm值的測定，采用100 mL裝液量時發酵液OD600 nm值最大，隨后隨裝液量的增大，發酵液OD600 nm值呈下降趨勢。

2.2.4 時間

在上述篩選出的最佳發酵條件的基礎上，分別對不同的發酵時間進行篩選。通過試驗可知，隨著搖菌時間的增加，其OD600 nm值也增加，在24 h時，其OD600 nm值達到最大，隨著搖菌時間的延長，自24 h后菌液含菌數開始逐漸減少，OD600 nm值緩慢變小，枯草芽孢桿菌進入生長衰亡期，如圖8所示。所以，最佳的搖菌時間為24 h。

2.2.5 溫度

在搖瓶發酵培養條件下培養24 h，測定發酵液的OD600 nm值。由圖9可知，高溫與低溫都對菌體生長不利。當發酵溫度是37 ℃時，其菌體生長量達到最高。溫度高于或低于37 ℃，含菌數都有所下降。因此，該菌株的最適發酵溫度是37 ℃。

2.2.6 轉速

如圖10所示，在轉速100～250 rpm·min-1條件下培養，在200 rpm·min-1時OD600 nm值最大，枯草芽孢桿菌的生長量最大，因此確定枯草芽孢桿菌最適發酵轉速為200 rpm·min-1。

3 結論

通過搖瓶單因素試驗，確定了枯草芽孢桿菌的最佳碳源是5 g·L-1麩皮∶酵母粉（3∶2），最佳氮源是10 g·L-1蛋白胨，選用NaCl作為該菌株發酵培養基的無機鹽。發酵最佳條件是發酵溫度為37 ℃，初始pH值為是6.0，接種量為4%，轉速為200 rpm·min-1。枯草芽孢桿菌發酵相關參數的研究為下一步其產業化發酵生產提供了良好的基礎。

（責任編輯：劉昀）