一株棘胸蛙源蛙病毒的分離與鑒定

程曉云 傅秋華 王衛(wèi)東

摘要 通過對棘胸蛙（Quasipaa spinosa）患病個體結合人工感染試驗、PCR檢測和系統(tǒng)發(fā)育分析對分離病原進行鑒定。結果表明，將患病的棘胸蛙肝、脾、腎等組織研磨勻漿液接種鯉魚上皮瘤細胞（EPC），出現(xiàn)明顯細胞病變。人工注射感染棘胸蛙表現(xiàn)出與自然患病相似的癥狀，14 d累計死亡率達到80%。通過對蛙病毒MCP基因的PCR檢測及系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，分離的棘胸蛙病毒與蛙病毒屬病毒的相似性在99%以上，且與蛙病毒屬FV3病毒類群聚為同一分支，暫命名為棘胸蛙蛙病毒（Quasipaa spinosa ranavirus，QSRV）。

關鍵詞 棘胸蛙;蛙病毒屬;鑒定

中圖分類號 S947.2 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）05-0100-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.027

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract The isolated pathogens were identified by combining with artificial infection test， PCR detection and phylogenetic analysis on the diseased individuals of Quassipaa spinosa. The results showed that the liver， spleen， kidney， and other tissues of the diseased Q.spinosa were inoculated into the squid epithelial cells （EPC）， and the cytopathic effect （CPE） appeared. The artificially injected infection of Q. spinosa showed similar symptoms with those of the natural disease， with a mortality rate of 80% on the 14th day. After PCR detection and phylogenetic analysis of the MCP gene of Ranavirus， the similarity between the isolated Quassipaa spinosa virus and the ranavirus was found to be more than 99%， and it was clustered with the ?FV3 virus group of Ranavirus. It was tentatively named as Quassipaa spinosa ranavirus （QSRV）.

Key words Quasipaa spinosa;Ranavirus;Identification

近年來，虹彩病毒可導致蛙類、龜鱉等兩棲爬行類以及眾多海、淡水魚類染病，并引發(fā)大量死亡，因而愈來愈受到關注。根據(jù)國際病毒分類委員會（CTV）第9次報告，虹彩病毒科被分為5個屬：虹彩病毒屬（Iridovirus）、綠虹彩病毒屬（Chloriridovirus）、蛙病毒屬（Ranavirus）、淋巴囊腫病毒屬（Lymphocystivirus）和腫大細胞虹彩病毒屬（Megalocytivirus）[1]。其中，蛙病毒屬（Ranavirus）是一類感染兩棲類、爬行類及魚類等動物的雙鏈DNA病毒。張奇亞等[2]于1996年從患有潰瘍性致死綜合癥的沼澤綠牛蛙（Rana grylio）分離到蛙病毒，并將其命名為沼澤綠牛蛙病毒（Rana grylio virus，RGV）。蛙病毒具有極強的傳播能力，近年來隨著兩棲爬行類品種養(yǎng)殖規(guī)模的逐漸擴大，蛙病毒感染造成的危害也愈加嚴重[3-5]。Green等[6]分析了1996—2001年美國兩棲類死亡事件，其中57%的兩棲類死亡事件與蛙病毒有關。

棘胸蛙（Quasipaa spinosa）是我國重點保護野生動物之一，也是我國養(yǎng)殖的特色經(jīng)濟蛙類，因其肉質細膩、鮮美、營養(yǎng)豐富，兼具食用和藥用功能，具有顯著的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益[7]。近年來，棘胸蛙養(yǎng)殖中的病害種類也逐漸增多，已陸續(xù)報道了歪頭病、白內障、爛皮病等病害[8-11]。2016年浙江等地的棘胸蛙養(yǎng)殖場陸續(xù)發(fā)現(xiàn)未知病原引起的病害，主要表現(xiàn)四肢腫脹或潰爛，腹部有發(fā)紅充血點。死亡率高，給養(yǎng)殖戶造成較大的經(jīng)濟損失。為明確其病因，筆者對浙江某棘胸蛙養(yǎng)殖場患病蛙進行了病原分離，通過回歸感染驗證其病原性，并對該病原進行分子生物學鑒定，旨在為該病的診斷與防控提供依據(jù)與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病棘胸蛙于2016年6月采自浙江省遂昌縣某養(yǎng)殖場，共采集病蛙3只（2雄、1雌），平均體質量為（45.5±7.8）g，用于病原分離;健康棘胸蛙幼蛙購自金華某養(yǎng)殖場，共25只，平均體質量為（23.0±1.5）g，用于人工感染試驗。胎牛血清（FBS）、M199培養(yǎng)基、0.25%的胰酶溶液（含EDTA）均購自 Hyclone公司;Vira DNA/RNA Kit試劑盒購自康為世紀。

1.2 臨床癥狀觀察及細菌學檢查

觀察送檢棘胸蛙體表及內臟情況，無菌操作取肝臟、脾、腎臟劃線接種于瓊脂平板，在30 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察細菌生長情況。

1.3 病毒培養(yǎng)

將患病的棘胸蛙內臟組織勻漿液按1∶5（V/V）加入混有雙抗（青鏈霉素活性為1 000 U/mL）的無菌水冰上研磨勻漿，4 ℃條件下12 000 r/min離心6 min，0.22 μm濾膜過濾后接種于單層的鯉魚上皮瘤細胞（Epithelioma papulosum cyprini，EPC）培養(yǎng)液中，25 ℃培養(yǎng)，盲傳3代，逐日觀察細胞病變。在EPC細胞70%～80%出現(xiàn)病變時收獲細胞培養(yǎng)物，-80 ℃和室溫條件下凍融2次，于4 ℃條件下4 000 r/min離心20 min，收集上清液，備用。采用Reed-Muech法[12]計算病毒半數(shù)感染量（TCID50）。