旱黃瓜未授粉子房雌核誘導技術體系研究

郭曉雨 宋曉飛 李曉麗

摘要 以4種不同基因型旱黃瓜的未授粉子房為試材，研究了基因型、子房不同發育時期及采樣時間、不同質量濃度的 TDZ、溫度對雌核誘導的影響，旨在探究旱黃瓜未授粉子房誘導雌核發育的技術體系。結果表明，不同基因型對雌核發育的影響差異顯著，“1503”的雌核啟動率最高，為77.22%;開花前1 d的樣品最優，此時1503雌核啟動率為95.56%;隨TDZ質量濃度上升，雌核啟動率呈先上升后下降趨勢，其中0.08 mg/L TDZ處理的1503雌核啟動率最高，達91.6%;35 ℃暗培養4 d的處理，雌核啟動率最優，達78.33%。旱黃瓜未授粉子房培養最優雌核誘導技術體系：以開花前1 d未授粉子房為材料，在添加0.08 mg/L TDZ的誘導培養基上進行35 ℃ 暗培養4 d。該研究成功建立了旱黃瓜未授粉子房雌核誘導技術體系，為旱黃瓜遺傳育種及基礎理論研究提供技術支撐。

關鍵詞 旱黃瓜;未授粉子房;雌核啟動率

中圖分類號 S642.2 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）05-0051-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.05.015

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract The effects of genotype， ovary development stage and sampling time， TDZ treatment with different mass concentration， and temperature on esterium induction were studied in unpollinated ovary of cucumber.The results showed that there were significant differences in the effects of different genotypes on the development of the female nucleus.The sample was optimal 1 day before flowering， when the activation rate of the female nucleus of “1503” was 95.56%.With the increase of TDZ mass concentration， the activation rate of female nucleus increased first and then decreased， among which the activation rate of 1503 female nucleus treated with 0.08mg /L TDZ was the highest， up to 91.6%.After dark culture at 35 ℃ for 4 days， the activation rate of female nucleus was the best， up to 78.33%.In this study， the optimal estrus induction technology system for the culture of unpollinated ovary of drought cucumber was as follows： the unpollinated ovary was taken as the material 1 day before flowering， and dark culture was conducted at 35 ℃ for 4 days on the induction medium supplemented with 0.08 mg/L TDZ.In this study， the technology system of ovum estrogennucleus induction in unpollinated ovary of drought cucumber was preliminarily explored， which provided technical support for the genetic breeding and basic theoretical research of drought cucumber.

Key words Drought cucumber;Nonpollination ovary;Female nuclear initiation rate

黃瓜（Cucumis sativus L.）為重要的蔬菜作物，北方旱黃瓜屬于華南型黃瓜[1]。我國環渤海灣地區和東北三省是旱黃瓜主作區和消費區。在黃瓜常規雜交育種中，雜交后代自交系的純合往往需要5～7年，而利用未授粉子房培養快速獲得純系是加速黃瓜育種的有效途徑[2-3]。San Noeum等[4]在大麥離體培養研究中首次提出“雌核發育”一詞。雌核發育誘導受基因型、取樣時期、培養條件、外源激素等因素影響。Shalaby[5]研究結果發現，南瓜的胚發生率為48%。李偉[6]發現，西葫蘆的胚誘導率為18.7%。在黃瓜上，劉立功等[7]以7種基因型為材料，研究發現不同基因型出胚率差異較大，最高出胚個數為25.3個，最低僅為0.7個。裴曉利等[8]以9種基因型為試材，結果發現“津優38”雌核啟動率最高，為92.33%。研究表明，西葫蘆、南瓜等以雌花開花當天的未授粉子房為材料，培養效果最好[9-10]。

在暗培養的時間和溫度等因素上，也有較多研究。在黃瓜上，25 ℃暗培養1 d的未授粉子房雌核啟動率最高為91.3%，噻苯隆（Thidiazuron，TDZ）有助于雌核發育[11-12]。在西葫蘆上，熱激處理5 d效果較佳[13]。在南瓜上，35 ℃處理下的未授粉子房胚發生率最高，達32.2%[14]。TDZ濃度也是影響雌核發育的重要因素，在TDZ濃度方面，在黃瓜離體雌核研究中，TDZ濃度為0.08 mg/L時雌核啟動率最高，為93.1%[11];在甜瓜離體培養中，以TDZ濃度0.02 mg/L時雌核啟動率最高，為65.8%[15];在西瓜中，以0.08 mg/L TDZ處理的反應率為最佳[16]。為此，筆者通過選擇基因型、子房不同發育時期、不同質量濃度的 TDZ、不同暗培養處理溫度，研究提高黃瓜全雌性雌核啟動率，以期提高黃瓜雜交育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料由河北科技師范學院黃瓜課題組提供，以華南型全雌旱黃瓜雜種一代的“1501”“1502”“1503”“1504”。

1.2 試驗方法

在植株開花前1 d 用鑷子取雌花節15～30 節、長度2.0～2.2 cm 未授粉子房為外植體，流水沖洗30 min，用體積分數75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖2 次，再用質量濃度0.1 g/L的 HgCl2溶液浸泡6 min，無菌水沖洗4～5 次，每次2 min，無菌濾紙吸凈表面的水分，用解剖刀去掉外植體花冠及瓜把，留取中間部分，剝去外植體表皮，切成1.0 mm厚的薄片，可明顯看見子房。各個試驗處理的外植體（3次重復，每次重復60片，總計180片）均接種至培養基（MS基本培養基+30 g/L蔗糖+10 g/L凝膠，pH 5.7，高溫滅菌 20 min）中，接種后于光照度 2 000 lx、光照時間16 h/d，電熱恒溫培養箱25 ℃暗培養5 d。

1.3 旱黃瓜未授粉子房雌核發育誘導設計

（1）不同基因型。取開花前1 d 的1501、1502、1503、1504為試材接種在誘導培養基（MS基本培養基+30 g/L蔗糖+10 g/L凝膠+0.08 mg/L TDZ，pH 5.7），35 ℃暗培養5 d。

（2）子房不同發育時期及采樣時間。①子房不同發育時期，調查開花前1、2、3、4、5 d和開花當天子房長度及花冠形態;②采樣時間，以1501、1502、1503、1504為試材，接種在誘導培養基（MS基本培養基+30 g/L蔗糖+10 g/L凝膠+0.08 mg/L TDZ，pH 5.7）中，25 ℃暗培養5 d。

（3）不同質量濃度的 TDZ處理。以1501、1502、1503、1504為試材，將子房切片分別培養在含0、0.06、0.08、0.10 mg/L TDZ的培養基（MS基本培養基+30 g/L蔗糖+10 g/L凝膠 ?pH 5.7）中，置于電熱恒溫培養箱 25 ℃暗培養 5 d。

（4）不同溫度。以1501、1502、1503、1504為試材，接種在誘導培養基（MS基本培養基+30 g/L蔗糖+10 g/L凝膠+0.08 mg/L TDZ， pH 5.7）中，于 25、30、35、37 ℃暗箱培養處理 5 d。

1.4 數據處理與分析

子房薄片培養7 d后，每1 d調查1次胚發生數（以有類似球形胚結構出現的子房塊計數），共調查3次，雌核啟動率=每處理子房切片總數/有胚發生子房塊數。試驗數據采用 DPS軟件（2008.01.15/版本）和 Excel 2016 軟件。

2 結果與分析

2.1 不同基因型對旱黃瓜未授粉子房雌核啟動率的影響

35 ℃暗培養5 d，5種不同基因型的雌核啟動率有明顯差異（表1）。1503的雌核啟動率達顯著水平，為 77.22%;1504的雌核啟動率最低，為48.33%。通過人工誘導培養的外植體其雌核啟動率與不處理的外植體雌核啟動率有顯著差異。

2.2 子房不同發育時期及采樣時間對旱黃瓜未授粉子房雌核啟動率的影響

結果表明，子房不同發育時期其子房長度、花冠形態和及采樣時間雌核啟動率表現不同。在植株開花盛期，取15～30節開花前1 d的未授粉子房，其長度為2.0～2.2 cm（表2），花冠呈黃綠色緊閉狀態（圖1 E）。1503開花前1 d的雌核啟動率達顯著水平，達95.56%（表3）。

2.3 不同濃度的TDZ對旱黃瓜未授粉子房雌核啟動率的影響

研究不同質量濃度的 TDZ 對4種基因型雌核啟動率的影響。結果表明，不同質量濃度的 TDZ在0、0.06、0.08、0.10 mg/L 中，1503的雌核啟動率在TDZ質量濃度 0.08 mg/L時最高，達91.67%;比TDZ質量濃度 0.00 mg/L時的雌核啟動率高85.19百分點。雌核啟動率最低的是 1502，在 TDZ質量濃度 0.00 mg/L時僅為 3.70%（表4）。

2.4 不同溫度對旱黃瓜未授粉子房雌核啟動率的影響

將4種不同材料在25、30、35、37 ℃下進行暗培養5 d。結果發現，1503在35 ℃下暗培養4 d時，雌核啟動率最高達78.33%（表5）。培養2 d時，切片可見球型（雌核，黃白色），培養5 d后，呈淡綠色（圖2）。

3 結論與討論

3.1 不同基因型對雌核啟動率的影響

研究表明基因型是西葫蘆雌核發育的影響因素[6];杜勝利等[17]首次在研究黃瓜離體雌核發育的影響因素中發現了基因型對黃瓜雌核發育有影響;在離體雌核培養中基因型是影響胚發育的重要因素之一，該研究結果發現在離體雌核培養中經過處理的不同基因型其雌核啟動率有明顯差異，進而證實基因型是影響雌核發育的因素。

3.2 子房不同發育時期及采樣時間對雌核啟動率的影響

子房發育時期對雌核發育有一定的影響。黃瓜只能從雌配子體晚期或成熟胚囊期的胚珠與子房培養誘導孤雌生殖。外植體的接種時期可能比培養基成分更為重要[18]。研究甜瓜離體雌核發育開花前1 d子房培養效果最好[19]，這與該試驗結果基本一致;在子房發育時期的研究表明取開花前1 d效果最好，胚狀體誘導率達83.3%[6];而同其他研究有較小差異，認為未授粉子房開花前2～3 d的胚誘導率最高，其原因可能是不同基因型、不同培養條件導致[20]。該試驗在植株開花盛期取15～30節開花前1 d的未授粉子房的雌核發育最高。

3.3 不同質量濃度的TDZ對雌核啟動率的影響

TDZ濃度對啟動雌核發育具有一定的誘導效果。TDZ具有類細胞分裂素的活性，促進植物體內類生長素物質合成的作用[21];研究表明0.06 mg/L時胚狀體誘導率最高為66.7%[22];但也有研究TDZ的使用對雌核發育有誘導影響，且濃度在0.04 mg/L時胚發生率最大[20];裴曉利等[8]在研究黃瓜離體雌核發育中發現濃度以0.08 mg/L時雌核啟動率為93.1%;而該試驗僅對TDZ一種外源激素進行了研究，在0、0.06、0.080和0.10 mg/L的處理中得出TDZ 0.08 mg/L 對雌核發育有較大影響，達91.67%。

3.4 不同溫度對雌核啟動率的影響

在南瓜未受精子房研究上表明暗培養35 ℃條件下5 d培養效果最好[23];在35 ℃ 暗培養3 d的反應率效果較好[24]。該試驗發現35 ℃暗培養4 d時，雌核啟動率最高。進一步說明35 ℃利于旱黃瓜雌核啟動率的發生。與前人研究有所差異，可能與基因型有關，需進一步研究。

4 結論

通過基因型、子房不同發育時期、不同質量濃度的 TDZ、不同溫度暗培養的旱黃瓜雌核誘導試驗研究發現，試材1503的雌核啟動率明顯高于1501、1502、1504 3種試材，進而證實基因型、子房不同發育時期、不同質量濃度的 TDZ，不同溫度是影響雌核發育的因素。該試驗結果表明，取植株開花盛期15～30節開花前1 d的未授粉子房，花冠緊閉，呈黃綠色，2.0～2.2 cm的外植體接種到添加0.08 mg/L的培養基上，35 ℃暗培養4 d利于旱黃瓜的雌核啟動率的發生。但此技術在旱黃瓜的實踐應用上還需深入研究。

雖然離體培養研究目前很受歡迎，但在實踐應用上會受到多因素影響（環境條件，操作人員，場所等），操作復雜，費時費力，易污染，建議工廠化管理應用，如何大面積推廣應用還有待進一步研究。

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