分離自血培養(yǎng)肺炎克雷伯菌的毒力基因及患者臨床特征分析

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，臨床微生物室，上海 200092

肺炎克雷伯菌是引起院內(nèi)感染常見(jiàn)的條件致病菌，常引起血流、肺及泌尿系統(tǒng)等感染[1]。我國(guó)Mohnarin耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)[2]顯示，引起血流感染的革蘭陰性病原菌中，肺炎克雷伯菌檢出率僅次于大腸埃希菌，位居第二。肺炎克雷伯菌引起的血流感染若得不到及時(shí)治療，易導(dǎo)致感染性休克與彌散性血管內(nèi)凝血等嚴(yán)重并發(fā)癥，患者病情兇險(xiǎn)，死亡率高。

19世紀(jì)80年代中國(guó)臺(tái)灣首次報(bào)道引起肝膿腫的高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella pneumoniae，hvKP），隨后日本、韓國(guó)、澳大利亞等地區(qū)相繼出現(xiàn)有關(guān)hvKP感染的病例報(bào)道[3]。肺炎克雷伯菌的毒力主要與莢膜多糖、脂多糖、鐵載體及菌毛等毒力因子密切相關(guān)，但各種毒力因子在hvKP的致病機(jī)制中發(fā)揮的作用仍不明確。不同于經(jīng)典肺炎克雷伯菌（classicKlebsiella pneumoniae，cKP），hvKP常常具有高黏液表型，又稱高黏液性肺炎克雷伯菌（hypermucoviscousKlebsiella pneumoniae，HMKP）；而cKP毒力雖較弱，較少引起肝膿腫、眼內(nèi)炎等轉(zhuǎn)移性感染病灶，但cKP對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥性高，給臨床抗感染治療帶來(lái)困難。有研究[4]表明，與黏液絲試驗(yàn)相比，檢測(cè)肺炎克雷伯菌的血清型（如K1型、K2型）及毒力基因（如rmpA、aerobactin基因）更適用于hvKP的篩選。本研究收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院2016年10月—2018年3月分離自血培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌，檢測(cè)菌株黏液表型、莢膜血清型及毒力基因，通過(guò)多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）對(duì)菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，收集并分析患者的臨床資料，了解分離自血培養(yǎng)肺炎克雷伯菌的毒力基因攜帶情況、莢膜血清分型、分子流行病學(xué)特點(diǎn)及患者臨床特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院2016年10月—2018年3月分離自血培養(yǎng)的非重復(fù)肺炎克雷伯菌80株，使用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。菌株于甘油肉湯中-80 ℃保存。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853及肺炎克雷伯菌ATCC700603由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 BACTECTM-FX血培養(yǎng)系統(tǒng)及血培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó)BD公司，BACT/ALERT 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀及血培養(yǎng)瓶、VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)、巧克力平板、革蘭陰性細(xì)菌鑒定卡（GNI）購(gòu)自法國(guó)Bio Mérieux公司，Micro flexTMMALDI-TOF MS全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Bruker Daltonik公司，血平板、麥康凱平板購(gòu)自上海伊華生物技術(shù)有限公司，電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，干式恒溫器購(gòu)自海門其林貝爾儀器制造有限公司，臺(tái)式高速離心機(jī)、PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，水平電泳儀、紫外凝膠成像儀均購(gòu)自上海天能科技有限公司。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 黏液絲試驗(yàn) 將凍存的菌株轉(zhuǎn)種至血平板，35 ℃孵育過(guò)夜，用無(wú)菌接種環(huán)挑取血平板上的單個(gè)菌落，重復(fù)3次。若黏液絲長(zhǎng)度大于或等于5 mm，判為黏液絲試驗(yàn)陽(yáng)性，即為HMKP；若不能挑起黏液絲或黏液絲長(zhǎng)度小于5 mm，判為黏液絲試驗(yàn)陰性。

1.2.2 莢膜血清型及毒力基因檢測(cè) 使用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板。通過(guò)擴(kuò)增wzi基因的方法檢測(cè)莢膜多糖（K抗原）血清型，擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交巴斯德研究所網(wǎng)站（https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html），獲得菌株的wzi分型及莢膜血清分型，引物序列、反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[5]。采用PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序方法檢測(cè)肺炎克雷伯菌常見(jiàn)的毒力基因，包括莢膜多糖相關(guān)毒力基因rmpA、rmpA2、magA和wcaG，鐵載體相關(guān)毒力基因aerobactin、iucA、iroN、entB、iutA、ybtS、ycf和kfu，菌毛編碼相關(guān)毒力基因mrkA、mrkD、fimA和fimH，毒力質(zhì)粒pLVPK相關(guān)基因pLVPK、silS和terW，脂多糖表達(dá)相關(guān)基因uge，尿囊素代謝相關(guān)基因allS、ureA。引物序列、反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參照相關(guān)文獻(xiàn)（表1）。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行Blast比對(duì)。

表1 血清型及毒力基因引物序列Tab 1 Primer sequences of serotypes and virulence genes

Continued Tab

1.2.3 hvKP的判定 目前尚無(wú)hvKP的統(tǒng)一判斷標(biāo)準(zhǔn)。參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]，本研究將同時(shí)攜帶rmpA和aerobactin基因的菌株，判為hvKP。

1.2.4 MLST 根據(jù)肺炎克雷伯菌官網(wǎng)（http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html）推薦的7個(gè)管家基因（gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB），進(jìn)行 PCR擴(kuò)增并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交MLST網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析，獲得菌株對(duì)應(yīng)的ST型。

1.2.5 臨床資料收集 通過(guò)臨床醫(yī)師電子病歷系統(tǒng)，收集住院患者相關(guān)臨床資料，包括感染類型、性別、年齡、科室、基礎(chǔ)疾病及并發(fā)癥等。感染類型[16]分為：①社區(qū)獲得性血流感染，即入院48 h內(nèi)血培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性。②醫(yī)院獲得性血流感染，即入院時(shí)不存在血流感染，入院48 h后血培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性；或由其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)入，入院后48 h內(nèi)血培養(yǎng)陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以±s表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；定性資料以頻數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黏液絲試驗(yàn)

2016年10月—2018年3月共收集80株分離自血培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌，黏液絲試驗(yàn)（圖1）篩選出9株HMKP，陽(yáng)性率為11.25%。

圖1 高黏液表型的肺炎克雷伯菌（黏液絲試驗(yàn)）Fig 1 HMKP in string test

2.2 莢膜血清型及毒力基因檢測(cè)結(jié)果

分離自血培養(yǎng)的80株肺炎克雷伯菌中，44株檢測(cè)出莢膜血清分型，以K14.K64型（24株）為主，以下依次為K1型（6株）、K2型（4株）、K16型（3株）、K25型（2株 ），K14、K80、K56、K31和 K15.K17.K50.K51.K52型各1株。莢膜血清分型未確定的肺炎克雷伯菌有36株，以wzi209為主（19株），以下依次為wzi173（5株）和wzi197（2 株 ），wzi73、wzi262、wzi278、wzi331、wzi337、wzi381、wzi535各1株，另有3株菌株未比對(duì)出wzi分型。

毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，所有菌株均攜帶entB、mrkA和ureA基因，ycf、mrkD和fimH基因檢出率均為98.75%，uge基因檢出率為96.25%，ybtS基因?yàn)?5.0%，fimA基因?yàn)?3.75%，pLVPK基因?yàn)?0.00%，silS基因?yàn)?8.75%，iutA基因?yàn)?1.25%，iucA、terW基因均為20.00%，rmpA、rmpA2和iroN基因均為18.75%，kfu、aerobactin、wcaG、magA、allS基因檢出率分別為16.25%、12.50%、10.00%、7.50%、5.00%。毒力基因在44株不同血清型肺炎克雷伯菌中的分布見(jiàn)表2。

表2 毒力基因在44株不同血清型肺炎克雷伯菌的分布（n）Tab 2 Distribution of virulence genes in 44 Klebsiella pneumoniae isolates with different serotypes (n)

同時(shí)攜帶rmpA和aerobactin基因的hvKP有10株，包括6株K1型、3株K2型和1株K16型。10株hvKP中有8株為HMKP，以HMKP篩選hvKP的陽(yáng)性符合率為96.25%。hvKP在HMKP與非HMKP菌株中的檢出率分別為88.89%（8/9）和2.82%（2/71），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=46.519，P=0.000）。

cKP血清型以K14.K64型（24株）為主，其次為K16型、K25型 各 2株，K2、K14、K80、K56、K31和K15.K17.K50.K51.K52型各1株，其余36株cKP的莢膜血清分型未確定。

2.3 hvKP與cKP血清型及毒力基因檢出情況比較

hvKP與cKP血清型及毒力基因檢出情況比較發(fā)現(xiàn)，K14.K64型主要檢出于cKP，K1型和K2型2種高毒力血清型主要分布于hvKP。magA、allS基因僅分布于K1型hvKP；毒力基因rmpA2、iutA、terW、silS、iucA、iroN、kfu、wcaG和pLVPK在hvKP中檢出率明顯高于cKP菌株，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。其他毒力基因分布無(wú)明顯差異（表3）。

表3 hvKP與cKP血清型及毒力基因檢出率比較[n（%）]Tab 3 Comparasion of serotypes and virulence gene detection rates between hvKP and cKP [n（%）]

2.4 MLST結(jié)果

分離自血培養(yǎng)的80株肺炎克雷伯菌中，76株有MLST分型結(jié)果，共檢出23種ST型別，包括ST11型43株，ST23、ST14及 ST307型各3株，ST17、ST36、ST147、ST380及ST792型各2株，ST37、ST45、ST111、ST218、ST261、ST323、ST585、ST660、ST661、ST700、ST881、ST950、ST1883及ST2159型各1株。有4株未檢出ST分型。

對(duì)菌株MLST分型及莢膜血清型分析發(fā)現(xiàn)，24株K14.K64型菌株包括23株ST11型和1株ST147型。6株K1型菌株包括3株ST23型、1株ST218型、1株ST2159型、1株ST700型。4株K2型菌株包括2株ST380型、1株ST881型、1株ST14型。

10株hvKP的MLST分型以ST23型（3株）和ST380型（2株）為主，其他為ST660、ST700、ST881、ST218和ST2159型各1株，70株cKP主要為ST11型（43株）。

2.5 hvKP與cKP來(lái)源患者的臨床特征比較

80例血培養(yǎng)檢出肺炎克雷伯菌的患者臨床資料顯示，hvKP引起的社區(qū)獲得性血流感染占50.0%，顯著高于cKP組（17.1%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049）。hvKP組與cKP組患者均以男性為多，年齡分別為（51.00±20.24）歲和（36.96±37.61）歲，2組間性別與年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。hvKP組科室分布以急診重癥監(jiān)護(hù)室為主（30.0%），cKP組以兒童重癥監(jiān)護(hù)室為主（31.4%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。hvKP組有40.0%患者患有糖尿病，明顯高于cKP組患者（10.0%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037）。80例患者中有4例合并肝膿腫患者，均檢出于hvKP組（表4）。

表4 hvKP與cKP引起血流感染患者的臨床特征比較Tab 4 Comparasion of clinical characteristics between the patients with bloodstream infection caused by hvKP and cKP

3 討論

具有高黏液表型的肺炎克雷伯菌能更有效地抵抗吞噬細(xì)胞及血清補(bǔ)體的溶菌活性，易隨血流播散至其他部位，引起多發(fā)性膿腫和多器官功能衰竭[3]。本研究黏液絲試驗(yàn)陽(yáng)性率為11.25%，與其他報(bào)道相似[17]；以HMKP篩選hvKP的陽(yáng)性符合率為96.25%，hvKP在HMKP與非HMKP中分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高黏液表型在一定程度上能夠反映肺炎克雷伯菌的毒力，可將黏液絲試驗(yàn)作為初步篩選hvKP的指標(biāo)。

本院分離自血培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌的莢膜血清型主要是K14.K64型，莢膜血清分型未確定的菌株以wzi209為主。研究[5]顯示，約95.0%的肺炎克雷伯菌可通過(guò)檢測(cè)莢膜基因座保守區(qū)wzi基因，得到莢膜血清分型。本研究有3株菌攜帶wzi基因，但在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中未獲得其對(duì)應(yīng)的莢膜血清分型。目前肺炎克雷伯菌的莢膜血清分型至少有77個(gè)[18]，K1、K2、K5、K54及K57型是常見(jiàn)的高毒力血清型，以K1和K2型菌株毒力最強(qiáng)，已成為引起肝膿腫的主要病原菌。本研究hvKP血清型以K1型和K2型為主，未檢出K5、K54及K57型等高毒力血清型菌株。文獻(xiàn)[19]報(bào)道，rmpA和magA基因的編碼產(chǎn)物能夠促進(jìn)莢膜多糖表達(dá)，使菌株呈現(xiàn)高黏液表型，但具有高黏液表型菌株不一定同時(shí)攜帶rmpA和magA基因。本研究中攜帶rmpA和magA基因的菌株均為高黏液表型菌株，而高黏液表型菌株中攜帶rmpA和magA基因的菌株占66.67%（6/9），與前述報(bào)道相符。

氣桿菌素（aerobactin）是肺炎克雷伯菌毒力增強(qiáng)的主要毒力因子，也是最重要的鐵載體，能夠使肺炎克雷伯菌毒力增強(qiáng)100倍[20]。本研究編碼氣桿菌素及其受體的iucA、iutA基因，以及編碼沙門菌素及其受體的iroN基因在hvKP中的檢出率顯著高于cKP，推測(cè)氣桿菌素可能與沙門菌素共同參與肺炎克雷伯菌鐵攝取能力的調(diào)控，從而增強(qiáng)菌株毒力。

rmpA2基因常與rmpA、iutA、terW和silS基因同時(shí)存在于大小為180 000～220 000 bp的毒力質(zhì)粒pLVPK上。獲得該毒力質(zhì)粒的肺炎克雷伯菌，毒力明顯增強(qiáng)[21]。研究[22]發(fā)現(xiàn)，前述5種毒力基因不一定同時(shí)存在，可能與毒力質(zhì)粒pLVPK易變區(qū)發(fā)生同源重組有關(guān)，但包含rmpA2、rmpA、iutA、terW和silS基因越多的菌株，存在類似pLVPK毒力質(zhì)粒的可能性越大。本研究檢出rmpA2基因的6株hvKP，均同時(shí)檢出rmpA、iutA、terW和silS基因及pLVPK，因此推測(cè)這6株hvKP的毒力增強(qiáng)，可能與獲得毒力質(zhì)粒pLVPK有關(guān)。wcaG基因（編碼巖藻糖，保護(hù)細(xì)菌逃避巨噬細(xì)胞的吞噬作用）、allS基因（編碼產(chǎn)物參與尿囊素代謝，為細(xì)菌生長(zhǎng)提供氮源）、kfu基因（編碼產(chǎn)物可促進(jìn)鐵離子的吸收）主要檢出于K1型hvKP，提示這些毒力基因可能在K1型肺炎克雷伯菌毒力增強(qiáng)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

菌毛能夠介導(dǎo)肺炎克雷伯菌定植于組織器官表面，與生物膜形成密切相關(guān)。研究[23]表明，能夠形成生物膜的hvKP，其侵襲能力明顯增強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)編碼Ⅰ型和Ⅲ型菌毛的fimA、fimH基因和mrkA、mrkD基因，在cKP與hvKP間分布無(wú)明顯差異，提示菌毛普遍存在于肺炎克雷伯菌；該結(jié)果與既往報(bào)道[24]相符。

本研究分離自血培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌共檢出ST11型、ST14型及ST23型等23種型別。有研究[25]顯示，hvKP與ST分型密切相關(guān)，ST23型K1菌株是hvKP主要的流行株。本研究K1型菌株以ST23型為主（50.0%），并檢出ST218型、ST700型和ST2159型。ST218型與ST23型相比，僅infB基因存在差異，兩者有高度的遺傳相關(guān)性。不同于hvKP的MLST分型結(jié)果，ST11型是cKP主要流行株（61.43%），與有關(guān)報(bào)道[26]相符。本研究有4株菌可能由于tonB基因發(fā)生突變，無(wú)法獲得其MLST分型結(jié)果[27]。

hvKP引起的血流感染以社區(qū)獲得性為主，主要檢出于急診ICU病區(qū)，患者住院時(shí)間短、預(yù)后較好，可能與hvKP對(duì)臨床常用抗菌藥物保持較高的敏感性有關(guān)。本研究4例肝膿腫患者血培養(yǎng)均檢出具有高黏液表型的hvKP，4株hvKP的血清型是引起肺炎克雷伯菌性肝膿腫常見(jiàn)的K1型（3株）和K2型（1株），因此推測(cè)這4例患者的肝膿腫也是由hvKP引起。糖尿病是肺炎克雷伯菌引起肝膿腫的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，糖尿病患者合并肝膿腫較非糖尿病患者的風(fēng)險(xiǎn)性增加3.6倍，并且更易發(fā)生眼內(nèi)炎、腦膜炎等轉(zhuǎn)移性感染[28]。本研究hvKP引起的血流感染患者中，糖尿病患者占40.0%，4例并發(fā)肝膿腫患者中有3例合并2型糖尿病，可能與糖尿病患者免疫功能下降以及高血糖環(huán)境有利于hvKP生長(zhǎng)繁殖有關(guān)[29]。

此次分離的hvKP比例較低（16.67%），可能與菌株分離自血培養(yǎng)有關(guān)。隨著侵入性操作的增多，患者醫(yī)院獲得性血流感染發(fā)病率升高，并且多由耐碳青霉烯類的cKP引起，而hvKP引起的血流感染易并發(fā)肝膿腫等侵襲性感染，因此臨床醫(yī)師應(yīng)對(duì)血培養(yǎng)分離出肺炎克雷伯菌的患者予以重視。