細胞骨架相關蛋白4對腫瘤診斷和預后的作用

劉錦燕，趙珺濤，王恒如，黃嘉儀，王鈺婷，項明潔,

1. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院盧灣分院放免檢驗科，上海 200020；2.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗科，上海 200025

惡性腫瘤是危害人類健康的疾病之一，其每年的全球發病率和死亡率分別為23.7%和30.0%[1]。在我國，人口老齡化、城市工業化等進程的加劇以及人們生活方式的改變等原因，使得近年來癌癥的發病數和死亡數持續增加。目前，由惡性腫瘤帶來的醫療負擔已成為全世界不容忽視的社會公共衛生問題。

細胞骨架相關蛋白4（cytoskeleton-associated protein 4，CKAP4），即p63，是一種非糖基化的Ⅱ型膜蛋白。該蛋白的氨基酸序列由3個部分組成，包括內質網腔內區、胞質區以及跨膜區。其胞質的?；稽c發生棕櫚?；?，可以錨定微管來維持內質網的空間分布。由于在結構上的相似、功能上的相近以及基因上的高度同源，CKAP4被納入p53家族（p53 family），該家族具有調控細胞周期、修復DNA損傷、誘導變異細胞凋亡等多樣抑癌功能。近年來越來越多的研究[2-4]針對CKAP4在腫瘤中的標志物作用展開，由于CKAP4在腫瘤組織、血清和細胞中的高度表達，推測其可能是多種腫瘤的標志物之一。本文就CKAP4的亞型和功能，以及CKAP4作為腫瘤診斷性指標及預后性指標的研究及應用進行綜述。

1 CKAP4的亞型與功能

1.1 CKAP4及其亞型

CKAP4由601個氨基酸組成，相對分子質量為65 800，具有106個氨基酸的氨基末端胞漿尾（AA 1-105），1個單一跨膜結構域（AA 106-127）和1個包含474個氨基酸的大胞漿結構域（AA 128-602）[5]。最初作為前高爾基體膜穩定的錨定駐留蛋白，CKAP4被發現存在于內質網（endoplasmic reticulum，ER）中，且該蛋白在胞內的功能與其N端的23個氨基酸息息相關，并在結構上通過自交聯固定在粗面內質網上[6]。

p63基因在延伸編碼的39個氨基酸序列中可發生突變，從而使得CKAP4在表觀功能上呈現出較明顯的差異。因此CKAP4分為2個亞型：一類為TAp63，具有p53性質；另一類為ΔNp63，缺乏p53相關功能[7]。

在表達部位方面，表皮中ΔNp63亞型的表達比TAp63更為豐富。在來源方面，ΔNp63存在于表皮、牙齒和毛囊中，而TAp63來自皮膚源性前體細胞（skin-derived precursors，SKPs）、真皮干細胞。TAp63和ΔNp63表達之間呈拮抗關系，研究[8]顯示在TAp63亞型選擇性丟失后，內源性ΔNp63α蛋白會表達上調，而當ΔNp63α亞型升高時，TAp63則隨之下調。

1.2 CKAP4的功能

不同亞型的CKAP4具有不同的功能。TAp63隸屬于p53家族，具有抑制癌細胞新陳代謝、誘導細胞衰老死亡、調控少數黏附基因等功能。然而在腫瘤細胞中TAp63亞型的占比較少，而ΔNp63亞型則主導了細胞黏附以及維持細胞存活的功能，在上皮發育中發揮不可缺少的作用，以促進癌細胞在人體內的存活?？梢哉f，在鱗狀細胞系中TAp63亞型的減少和ΔNp63亞型的增多造成了腫瘤侵襲和轉移功能相關基因的上調。因此，大多數腫瘤細胞中CKAP4因ΔNp63亞型水平的增高而表達上調，常標志預后不良、病情惡化；少數腫瘤中CKAP4因TAp63亞型的下調而表達水平降低，亦成為預后不良的指征。此外，Carroll等[8]發現ΔNp63亞型會抑制p53家族的轉錄，但近年來研究[6,9-11]證明ΔNp63亞型對大量基因如整合素β4、α6和α3，層連蛋白γ2以及纖維連接蛋白的轉錄和表達均具有促進調節的作用。

2 CKAP4在腫瘤診斷中的價值

2.1 CKAP4在腫瘤細胞中的表達及診斷價值

2.1.1 肺癌 Bir等[12]對62例原發性肺癌組織樣本進行了CKAP4免疫組織化學染色，結果顯示在5個肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell cancer，LSCC）中的24個樣本呈強陽性，20個肺腺癌中的6個樣本及1個大細胞癌樣本呈輕度陽性；繼而說明，CKAP4染色在低分化LSCC中有顯著特異性。Yanagita等[2]研究了正常肺組織及70例手術切除的肺癌組織，包括42例肺腺癌（lung adenocarcinoma）、24例LSCC、2例小細胞肺癌（small cell lung carcinoma，SCLC）和2例肺大細胞神經內分泌癌（large cell neuroendocrine carcinoma，LCNEC）；結果顯示，CKAP4在4種肺癌腫瘤細胞的細胞質和腫瘤間質中的成纖維細胞中均有所表達，而正常肺支氣管上皮細胞、肺泡細胞或基質細胞中均未見表達。目前，CKAP4已被作為特異性標志物廣泛應用于LSCC的組織病理學診斷[13]。

Lilo等[14]對126例肺癌患者的細針穿刺細胞進行研究，包括50例肺腺癌、56例LSCC、8例SCLC和12例未分化癌；結果發現，在上述前3類肺癌細胞中CKAP4的陽性表達率分別為62.8%、89.5%和50.0%，且在未分化癌細胞內則未檢測到CKAP4表達。繼而說明，CKAP4的肺癌診斷靈敏性上還存在一定局限。

2.1.2 乳腺癌 Maeda等[3]對乳腺纖維腺瘤（fibroadenoma，FA）和乳腺導管原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）的組織樣本進行雞尾酒染色[即多種蛋白抗體包括CKAP4和細胞角蛋白（cytokeratin，CK）7、18、5、14抗 體的聯合應用，進行組織學診斷］，結果發現DCIS患者的CKAP4免疫陽性的數量與FA患者間存在較大差異（P=0.005），提示CKAP4可用于鑒別FA和DCIS。

同樣地，Tanaka等[15]研究了103例通過細針穿刺收集的乳腺組織樣本，進行雞尾酒染色，結果顯示CKAP4對乳腺癌的診斷敏感度和特異度分別為97.8%和91.7%。Osugi等[16]采用液基細胞學（liquid based cytology，LBC）對乳腺癌經細針穿刺采集的細胞進行處理后再行CKAP4免疫染色，并與常規巴氏染色法進行比較。結果顯示，CKAP4免疫染色法的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷準確率分別為99.0%、99.0%、99.5%、97.8%、99.0%，而常規巴氏染色法則分別為88.3%、89.1%、94.8%、77.4%、88.6%；提示CKAP4免疫染色法更優。

2.1.3 食管癌 Shinno等[17]對119例食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者的食管黏膜組織樣本進行研究，通過免疫組織化學染色和mRNA水平檢測CKAP4；免疫組織化學染色結果顯示CKAP4在66例患者的腫瘤組織中呈陽性，而mRNA水平檢測顯示CKAP4在86例患者的腫瘤組織中呈陽性，且與非腫瘤區域相比CKAP4基因mRNA水平有顯著升高。同時，該研究針對免疫缺陷的小鼠模型進行分析發現，CKAP4是體內形成ESCC腫瘤所必需的。

2.1.4 肝癌 Li等[18]研究發現，在139例肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者的組織樣本中，有63.6%的腫瘤組織存在CKAP4高度表達，而在鄰近的正常組織中僅有39.2%的樣本高表達CKAP4，在腫瘤組織和正常組織中該蛋白的表達差異具有統計學意義。

2.1.5 胃癌 Song等[19]對101例胃癌黏膜組織樣本進行研究，發現CKAP4在49個樣本中強表達、52個樣本中弱表達；而在25個正常胃黏膜組織樣本中，則僅在6個樣本中強表達、19個樣本中弱表達；且在胃癌黏膜組織和正常胃黏膜組織樣本中，CKAP4的表達間差異具有統計學意義。

2.1.6 淋巴瘤 Fukushima等[20]研究了65例彌漫大 B 細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）、28例濾泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）和5例套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）的非霍奇金淋巴瘤組織樣本，結果顯示有22例（33.8%）DLBCL和15例（53.6%）FL的樣本中存在CKAP4表達，而5例MCL樣本中均未有表達。

2.2 CKAP4在血清中的表達及診斷價值

2.2.1 肝癌 朱錦舟等[4]研究了88例HCC、91例肝硬化、87例慢性乙型肝炎患者及健康對照者的血清樣本，結果顯示HCC患者血清樣本中CKAP4的表達水平高于其他3組，且差異具有統計學意義（均P＜0.001）。在HCC患者血清樣本中，CKAP4與甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）相比，差異無統計學意義（P=0.248）；且在早期HCC的診斷指標中，CKAP4的敏感度為 78.4%、特異度為 73.7%，均優于AFP。因此提示，CKAP4可作為HCC診斷的血清腫瘤標志物。

2.2.2 胰腺癌 Kimura等[21]通過2種酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測發現胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）患者組的血清CKAP4值高于對照組，且其可在PDAC細胞的小細胞外囊泡（small extracellular vesicles，SEV）中被檢測到，表現出外泌體特征。繼而提示，外泌體中分泌的CKAP4可作為PDAC的血清腫瘤標志物。

2.2.3 肺癌 Yanagita等[2]針對271例肺癌患者和100例健康對照者的血清樣本中的CKAP4檢測發現，肺癌患者的CKAP4水平顯著高于健康對照者（P=0.000），且Ⅰ期肺腺癌或LSCC患者的血清中CKAP4水平也高于健康對照者（P=0.000）；繼而提示，CKAP4可作為肺癌早期診斷的血清腫瘤標志物。

2.2.4 食管癌 Chen等[22]通過對207例ESCC患者的血清CKAP4進行研究發現，患者的血清CKAP4水平高于健康對照者（P＜0.001），通過血清CKAP4鑒定ESCC的受試者操作特征曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.675；此外，隨訪后通過多因素Logistic回歸分析發現病理性淋巴結轉移是最差的預后因素，其次是血清CKAP4水平的異常上調。上述結果表明，血清CKAP4水平可能是ESCC潛在腫瘤標志物。

3 CKAP4在腫瘤預后判斷中的價值

CKAP4與多類腫瘤的預后存在相關性。Shinno等[17]的研究顯示，在119例ESCC患者中有46例（38.7%）患者的Dickkopf-1（DKK1）和CKAP4均為陽性，而該2種蛋白質表達的患者表現出不良的預后和較差的無復發生存率；經多變量分析顯示，該2種蛋白質的表達是ESCC不良預后因素。Takahashi等[23]也針對ESCC的患者的CKAP4和p53的蛋白表達及預后進行研究，結果顯示不表達上述蛋白的患者的生存率明顯較低（P=0.030）。在Massion[24]對LSCC的研究中發現，p63基因組擴增和蛋白質染色強度與患者術后更好的生存率相關，且在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者中p63的擴增和過表達可延長患者的存活期。Sun等[25]發現5%的透明細胞腎細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）患者出現CKAP4過表達，預后明顯惡化（CKAP4的上調與ccRCC的惡化特征有關）。Song等[19]對CKAP4與胃癌患者的預后情況進行研究，通過單變量分析顯示陽性CKAP4表達與較短的生存率、較低的5年生存率顯著相關（P=0.001）；Cox多因素回歸分析顯示，轉酮醇酶 1（transketolase-like protein 1，TKTL1）和CKAP4的表達是胃癌的獨立預后因素。Ma等[13]則發現，在LSCC中具有高表達水平的CKAP4的患者的生存率顯著高于低表達水平的患者（P＜0.050）；經Cox多因素回歸分析顯示，高表達水平的CKAP4是良好存活的獨立預后因素。Li等[18]認為在HCC生存分析中，與低表達CKAP4的患者相比，高表達的患者似乎具有更長的總體生存期和無病生存期。Hegazy等[26]發現，在膀胱癌中CKAP4的低表達（P=0.005）與腫瘤復發、進展之間存在顯著相關性。Loljung等[27]對舌鱗狀細胞癌研究發現，CKAP4表達與患者的2年生存率顯著相關（P=0.018）；若有超過80.0%的腫瘤細胞強表達CKAP4，則患者的2年生存率較低；且在5年生存率中，CKAP4高表達與較差的預后相關性更加明顯。Zhou等[28]對中國人腺樣囊性癌進行研究發現，CKAP4陽性表達是患者5年生存率較好的預后指標；同時，不同于歐美的相關研究[29]，該研究還發現CKAP4陽性表達是患者10年生存率較差的預后指標。

4 結論

CKAP4是定位于細胞內質網上的結構穩定蛋白，主要分為TAp63亞型和ΔNp63亞型。前者屬于p53家族，具有抑制腫瘤細胞等作用；后者具有主導細胞黏附及存活的功能，能夠在上皮細胞發育中發揮關鍵作用，且在大部分腫瘤細胞中CKAP4因ΔNp63的高表達而呈現高水平表達。隨著癌細胞進一步浸潤發展，在上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的過程中ΔNp63受到抑制、CKAP4水平可能也逐漸下降；而癌癥后期低水平的CKAP4則是預后不良的體現。

在臨床診斷中，CKAP4指標可廣泛應用于肺癌、乳腺癌、食管癌、肝癌、淋巴瘤、舌癌、腺囊樣癌、頭頸癌等[28,30-31]惡性腫瘤，尤其是LSCC和乳腺癌的診斷中，且特異性和靈敏性均已得到證實。然而，將CKAP4作為血清學診斷指標進行的研究尚不多見。現有研究結果表明，作為診斷指標之一，CKAP4在肝癌、胰腺癌、肺癌、食管癌等惡性腫瘤中具有一定的應用前景。而在預后指標應用中，CKAP4在不同腫瘤以及各腫瘤不同階段的差異性較大，且研究結論尚存在矛盾之處，這可能與其2個亞型在不同部位的表達及相互拮抗的作用有關，尚需要開展進一步研究。