白藜蘆醇對小鼠結腸運動的抑制作用和機制研究

楊 夢 ，陸紅麗，黃 旭，許文燮

1. 荊楚理工學院醫學院生理教研室，荊門448000；2. 上海交通大學基礎醫學院解剖與生理學系，上海200240

白藜蘆醇（resveratrol，Res），又稱為3, 4', 5-三羥基-反式-二苯乙烯，是一種天然的多酚化合物，存在于花生、葡萄、桑葚等多種植物之中。Res具有保護心血管[1-4]、抗癌、抗衰老、抗菌消炎等作用[5-7]。研究表明，Res是一種植物雌激素，可以舒張血管平滑肌[8]、胃、十二指腸[9-10]和膽囊[11]；在不同的平滑肌組織中，Res的作用機制并不一致；而有關Res對結腸運動的作用和機制尚未見報道。

結腸運動是結腸傳輸的動力。在哺乳動物中，結腸移行性復合運動（colonic migrating motor complex，CMMC）是糞便排出的主要推進性收縮[12]。CMMC是一種復雜的生理活動，受腸神經和2種間質細胞［即Cajal間質細胞（interstitial cells of Cajal，ICC）和血小板衍生生長因子受體α陽性細胞（platelet-derived growth factor receptor α-positive cells，PDGFRα+細胞）］的共同調節[13-15]。而且，結腸平滑肌的收縮與平滑肌細胞上的K+通道和電壓依賴性Ca2+通道密切相關[16-19]。

結腸運動障礙引起結腸功能紊亂，可見于多種疾病。在治療中，一些化學藥物的不良反應十分明顯，所以越來越多的研究集中在低毒性的天然來源的植物化學物質。而且，Res存在于多種食物之中，研究其對胃腸道運動的作用，尤其對結腸運動的作用，具有重要的生物醫學意義。本研究旨在闡明Res對小鼠結腸運動的作用和機制，以期為Res的臨床開發和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器 SZX12型解剖顯微鏡、IX-70倒置顯微鏡（日本Olympus Optical公司），JZJ01H型張力換能器、RM6240系列多通道生理信號采集處理系統（中國成都儀器廠），P97微電極拉制儀（美國Sutter公司），EPC-10膜片鉗放大器（德國HEKA公司）。

1.1.2 試 劑 Res、Bayk8644、apamin、 四 乙 基 銨（tetraethylammonium，TEA）、河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）、Nω-硝 基 -L-精 氨 酸 甲 酯（Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）、阿托品和5-硝基-2-（3-苯基丙基氨基）苯甲酸[5-nitro-2-（3-phenylpropylamino）benzoic acid，NPPB]均購自美國Sigma公司。

1.1.3 動物 4～5周的成年雄性ICR（Institute of Cancer Research，美國癌癥研究所）小鼠由中國科學院上海實驗動物中心提供［生產許可證號為SCXK（滬）2018-007，使用許可證號為SYXK（滬）2018-0027］，在20～25 ℃下飼養，飲食不限制。研究經上海交通大學醫學院動物實驗倫理委員會審批。

1.2 實驗方法

1.2.1 結腸平滑肌自發性收縮的記錄 實驗前1日配置溶液和藥品。Krebs溶液：葡萄糖 11.5 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，NaCl 121.9 mmol/L，NaHCO315.5 mmol/L，KCl 5.9 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L。將Res、Bayk8644和NPPB溶解在二甲基亞砜中。將apamin、TEA、TTX、L-NAME、atropine溶解于雙蒸水。所有藥物均保持在-20 ℃。用異氟烷麻醉并脫頸處死小鼠，將結腸迅速取出、移至氧飽和的Krebs溶液。在解剖顯微鏡下，除去黏膜和黏膜下層，將結腸平滑肌組織切成小條（2 mm×8 mm）。使用絲線系住兩端，將肌條的一端固定在38 ℃、氧飽和的10 mL浴槽溶液中，另一端連接張力換能器，換能器與多通道生理信號放大器相連，通過電腦記錄肌條的自發性收縮[20]。首先使用8只小鼠，觀察 Res（10、20、40和 80 μmol/L）對肌條的作用，對比同一肌條在Res處理前后的自發性收縮。然后觀察各種阻斷劑或激動劑對Res作用的影響。具體如下：先觀察記錄Res對肌條的作用，洗脫之后用各種阻斷劑或激動劑預處理肌條，再觀察記錄Res對肌條的作用。對比同一肌條預處理前后Res的作用。各阻斷劑或激動劑預處理所用的小鼠例數如下：L型Ca2+通道激活劑BayK8644（n=4）、非選擇性K+通道阻滯劑TEA（n=9）、Na+通道阻滯劑TTX（n=8）、膽堿能神經元抑制劑阿托品（n=5）、NO合酶抑制劑L-NAME（n=10）、ANO1（anoctamin 1）通道抑制劑NPPB（n=4）和SK3通道抑制劑apamin（n=6）。

1.2.2 CMMC的記錄 用異氟烷麻醉并脫頸處死小鼠（n=6），迅速取出結腸放入氧飽和的Krebs溶液。在解剖顯微鏡下切除腸系膜，用1 mL注射器人工排出糞便顆粒，并將與模擬糞便顆粒連接的玻璃毛細管插入腸管。之后，移入矩形容器，其中充滿20 mL溫度為（38.0±0.5）℃、氧飽和的Krebs溶液；將結腸固定在硅膠板底部，將絲線連接到結腸的近端和遠端，通過張力換能器連接到放大器裝置[21]。通過電腦記錄Res對CMMC的作用，記錄和對比同一離體結腸經Res處理前后的遠端和近端CMMC。

1.2.3 結腸平滑肌細胞的分離 實驗前1日配置無鈣生理鹽水：NaCl 134.8 mmol/L，KCl 4.5 mmol/L，葡萄糖 5 mmol/L，MgCl2· 6H2O 1 mmol/L，HEPES 10 mmol/L， 用 Tris 調 節至pH 7.40。用異氟烷麻醉并脫頸處死小鼠，迅速取出結腸放入氧飽和的無鈣生理鹽水。在顯微鏡下，除去黏膜和黏膜下層，將肌肉層切成小段（1 mm×4 mm），放入裝有無鈣生理鹽水的試管中，保持在4 ℃。然后配置消化液：在1 mL 無鈣生理鹽水中加入Ⅱ型膠原酶4 mg、胰蛋白酶抑制劑8 mg、牛血清白蛋白8 mg、二硫蘇糖醇2 μmol、木瓜蛋白酶2 μmol，保持在4 ℃，備用。之后將肌條放入裝有1 mL消化液的試管中，在37.5 ℃下消化20～30 min，然后用無鈣生理鹽水多次洗滌肌條，保持在4 ℃，備用[22]。

1.2.4 電生理記錄 實驗前1日，配置記錄鋇電流（barium currents，IBa）的灌流液：NaCl 134.8 mmol/L、KCl 4.5 mmol/L、 葡萄糖 10 mmol/L、MgCl2·6H2O 1 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、BaCl210 mmol/L， 用 Tris調 節 至pH 7.40；配置記錄IBa的電極內液：CsCl 125 mmol/L、TEA 20 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Na2ATP 2 mmol/L、MgCl2· 6H2O 4 mmol/L， 用 Tris調 節至pH 7.35。用平滑玻璃口的滴管反復吹打肌條（n=6），直至溶液渾濁，形成平滑肌細胞懸浮液。從試管中取懸浮液平鋪于倒置顯微鏡的灌流槽中，10～15 min之后開始灌注。實驗在20～25 ℃進行，玻璃電極的電阻為2～4 MΩ，采用膜片鉗技術的全細胞記錄模式，用膜片鉗放大器記錄L型Ca2+電流細胞[23]。

1.3 統計學方法

使用Origin 7.5軟件分析數據，數據以±s表示。使用單因素方差分析（one-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test）評估多組數據，并使用t檢驗比較配對的2組數據。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Res對小鼠離體結腸平滑肌自發性收縮和CMMC的影響

Res以劑量依賴的方式顯著抑制小鼠離體結腸平滑肌自發性收縮，10、20、40和 80 μmol/L Res分別抑制收縮幅度 至（86.08±4.43）%、（67.46±4.12）%、（40.59±5.64）%和（17.42±3.78）%（均P＜0.05，圖1A、C）。Res顯著抑制小鼠離體結腸近端和遠端的CMMC至（63.13±14.82）%和（61.23±5.18）%（P=0.031，P=0.001，圖 1B、D）。

圖1 Res對小鼠離體結腸自發性收縮和CMMC的影響Fig 1 Effects of Res on colonic spontaneous contraction and CMMC in mice

2.2 腸神經系統和2種間質細胞在Res抑制結腸平滑肌自發性收縮中的作用

施用TTX前后，Res分別抑制收縮幅度至（56.75±5.27）%和（49.27±8.94）%（圖2A、D）；施用atropine前后，收縮幅度被抑制到（75.06±9.38）% 和（71.19±10.22）%（圖2B、E）；施用L-NAME前后，收縮幅度被抑制至（52.43±5.64）% 和（44.68±7.08）%（圖 2C、F）。與 Res單獨作用組相比，抑制劑+Res組收縮幅度無明顯變化（P＞0.05），說明3種抑制劑均不能顯著阻斷Res對結腸平滑肌自發性收縮的抑制作用。

圖2 TTX、atropine和L-NAME對Res抑制小鼠結腸自發性收縮的影響Fig 2 Effects of TTX, atropine and L-NAME on Res-suppressed colonic spontaneous contraction in mice

施用apamin前后，收縮幅度分別被Res抑制至（42.38±6.38）% 和（46.51±3.49）%（圖 3A、C）；施用NPPB前后，收縮幅度分別被Res抑制至（58.39±6.23）%和（49.31±14.76）%（圖3B、D）。與Res單獨作用組相比，抑制劑+Res組收縮幅度無明顯變化（均P＞0.05），說明這2種抑制劑也不能顯著阻斷Res對結腸平滑肌自發性收縮的抑制作用。

圖3 Apamin和NPPB對Res抑制小鼠結腸自發性收縮的影響Fig 3 Effects of apamin and NPPB on Res-suppressed colonic spontaneous contraction in mice

2.3 離子通道阻斷劑在Res抑制結腸平滑肌自發性收縮中的作用

用TEA預處理前后，收縮幅度分別被Res抑制至（43.89±8.08）% 和（59.93±4.77）%（圖 4A、C），差異無統計學意義（P＞0.05），提示非選擇性K+通道阻滯劑TEA對Res的抑制作用沒有影響。

用BayK8644預處理前后，結腸平滑肌自發性收縮被Res抑制至（44.09±13.41）%和（84.56±6.09）%；與Res單獨作用組相比，BayK8644+Res組中Res的抑制作用明顯被阻斷（P=0.031，圖4B、D），提示L型Ca2+通道激活劑BayK8644可顯著阻斷Res的抑制作用。

圖4 TEA和BayK8644對Res抑制小鼠結腸自發性收縮的影響Fig 4 Effects of TEA and BayK8644 on Res-suppressed colonic spontaneous contraction in mice

2.4 Res對L型Ca2+通道電流的影響

在新鮮分離的結腸平滑肌細胞上，在傳統的全細胞模式下，將膜電位鉗制在-80 mV，每10 s給予10 mV增加幅度的階躍刺激，使其去極化依次從-40 mV至70 mV，時間持續440 ms，記錄IBa。在I-V關系曲線（current-voltage relation curve）中，從-20 mV至50 mV，40 μmol/L Res顯著降低 IBa（均P＜0.05，圖 5A、B）；在0 mV時，IBa被抑制至（35.92±6.88）%（圖5C）。

圖5 Res對L型Ca2+電流的影響Fig 5 Effect of Res on L-type Ca2+ current

3 討論

在本研究中，Res顯著抑制結腸平滑肌的自發性收縮和CMMC；Res對結腸平滑肌自發性收縮的抑制作用不受TTX、atropine、L-NAME、NPPB、apamin、TEA的影響，卻被 BayK8644顯著阻斷且Res直接抑制結腸平滑肌細胞的L型Ca2+通道電流。這些結果表明，Res對結腸平滑肌運動的抑制作用可能通過L型Ca2+通道介導。

正常情況下結腸運動受腸神經調節，主要包括興奮性的膽堿能神經[13]和抑制性的氮能和嘌呤神經[14]。報道的Res的作用機制在不同平滑肌的組織中存在差異。Res能舒張大鼠胃和十二指腸、豚鼠胃底平滑肌和人膽囊，與NO通路有關[9-11]；但是Res舒張血管的作用與NO通路無關[8]。因此，在本研究中，我們首先研究了Res的抑制作用是否與腸神經系統有關，分別使用TTX來阻斷腸神經系統、阿托品阻斷膽堿能神經、L-NAME（NO合酶抑制劑）來阻斷平滑肌的NO合成；結果發現Res的抑制作用不受這些藥物的影響。繼而表明，Res對結腸的抑制作用可能與神經系統沒有關系。

除了神經系統，結腸運動還受2種間質細胞的調節。ICC 是胃腸平滑肌自動節律性運動的起搏細胞，其上表達的ANO1通道產生起搏電流，使平滑肌去極化產生慢波，并激活平滑肌細胞L型Ca2+通道產生快波，引起平滑肌收縮[24]；SK3通道在PDGFRα+細胞上高表達，而在ICC和平滑肌細胞上表達量則非常少[25]，SK3通道被激活會引起PDGFRα+細胞的超極化，又通過縫隙連接使相鄰的平滑肌超極化，抑制平滑肌L型Ca2+通道，引起平滑肌舒張[24]。為研究Res的抑制作用是否與2種間質細胞有關，我們分別用NPPB阻斷ANO1通道、apamin阻斷SK3通道，結果發現Res的抑制作用不受影響，繼而說明Res對結腸的抑制作用可能與2種間質細胞無關。

平滑肌的收縮性與平滑肌細胞膜上的離子通道密切相關。K+通道在維持靜息膜電位和平滑肌松弛方面起重要作用[16-17]。平滑肌細胞中有3種外向鉀電流，即延遲整流鉀電流（IKV）、鈣激活鉀電流（IKCa）和瞬時外向鉀電流（Ito）[26]。Wade等[17]證明IKV在調節食管肌肉靜息張力方面起主導作用，而IKCa在很大程度上限制了與激發相關的收縮。此外，ATP依賴性K+通道參與慢波的形成，并參與硫化氫對胃腸和血管平滑肌的抑制[18,27]。據報道[9-11]，Res對大鼠胃和十二指腸、豚鼠胃底平滑肌和人膽囊的舒張作用與ATP敏感性K+通道有關，對人膽囊的舒張作用還與大電導鈣激活K+通道通路有關。在我們的實驗中，TEA（非選擇性K+通道阻滯劑）不能阻斷Res的抑制作用，說明K+通道可能沒有參與Res對小鼠結腸的抑制作用。

胃腸平滑肌的快波形成和肌肉收縮均由鈣內流引起，Ca2+通道的開放和膜電位相關聯，是電壓依賴性Ca2+通道[19]，其可分為L型和T型等。與T型相比，L型電壓依賴性Ca2+通道有以下特點：高閾值、大電導；失活慢，開放時程長；當用Ba2+代替細胞外Ca2+時，L型Ca2+電流幅度增大，而T型Ca2+電流不受影響；L型對BayK8844敏感，而T型對其不敏感[28]。在動作電位期間，細胞外Ca2+離子主要通過L型Ca2+通道進入平滑肌細胞而引起收縮。L型是胃腸道平滑肌細胞膜中主要的電壓依賴性Ca2+通道[19]。據報道，Res通過抑制L型Ca2+通道而舒張兔主動脈、大鼠的胃和十二指腸[15-16]。在本研究中，Bayk8644（L型 Ca2+通道激活劑）可顯著阻斷Res對結腸平滑肌自發性收縮的抑制作用。為進一步證實Res的抑制作用與L型Ca2+通道有關，我們使用全細胞膜片鉗技術，觀察Res對新鮮分離的結腸平滑肌細胞上L型Ca2+通道電流的影響，發現在I-V曲線中，從-20 mV到50 mV Res可顯著抑制IBa。這些結果表明Res可能通過直接抑制L型Ca2+通道電流來抑制結腸平滑肌運動。

綜上所述，本實驗中Res顯著抑制小鼠的結腸運動，其機制可能與結腸平滑肌細胞L型Ca2+通道的抑制有關，而腸神經系統、NO信號通路、2種間質細胞和K+通道可能不參與Res的抑制作用。