白念珠菌ERG3基因敲除及其對耐藥性的影響

王鈺婷 ，劉錦燕，史 冊，趙珺濤 ，項明潔

1. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗科，上海 200025；2. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院盧灣分院放免檢驗科，上海 200020

白念珠菌是臨床上最常見的條件致病性真菌，可存在于人體的皮膚、口腔、胃腸道、陰道等部位。一般情況下，該菌在正常機體中數量較少，不會引起疾病。當人體免疫力低下時，其可轉換成致病菌引起表淺感染，嚴重時則可引發危及患者生命的念珠菌血癥[1-2]。近年來，廣譜抗生素的濫用以及免疫功能缺陷患者的不斷增多致使臨床念珠菌的感染率和死亡率呈上升趨勢，其中以白念珠菌感染最常見[3-4]。

臨床上用于治療白念珠菌的常用藥物有多烯類、唑類、嘧啶類和棘白菌素類等，其中三唑類藥物[如氟康唑（fluconazole，FCZ）、伏立康唑（voriconazole，VRC）、伊曲康唑（itraconazole，ITR）]因其抗菌譜廣、療效顯著、生物利用度高和毒副作用低等優點，常作為臨床治療中的一線用藥。唑類藥物的抑菌機制是其可作用于白念珠菌細胞膜麥角固醇合成中的關鍵酶，使白念珠菌細胞膜甾醇合成通路受阻、細胞膜完整性破壞及菌體內有毒的甲基化固醇類物質累積而達到抗真菌作用[5]。然而，在臨床頻繁的預防經驗用藥中，耐藥性的產生給該類藥物的應用帶來很大困難[5-6]。

甾醇合成通路改變主要是由△5,6- 去飽和酶的失活引起，該酶由ERG3（Ergosterol 3）基因編碼[7]。唑類藥物通過抑制14α- 去甲基化酶（14α-demethylase，14-DM）發揮抑菌作用，當ERG3發生突變或缺失后就不能編碼有活性的△5,6- 去飽和酶，致使中間積聚的產物變成14α- 甲基法尼醇，它可以代替部分麥角固醇的功能，使細胞繼續生長繼而導致耐藥產生。

本研究在Noble等[8]提出的構建白念珠菌基因敲除株策略基礎上稍作改進，高效獲得白念珠菌ERG3基因敲除株，并就ERG3敲除對白念珠菌唑類藥物耐藥性及其常見耐藥基因的表達進行分析，以期為深入研究白念珠菌的耐藥機制奠定基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象、引物及試劑

1.1.1 菌株和質粒 藥敏標準白念珠菌ATCC90028由本實驗室保存，DH5α大腸埃希菌化學感受態細胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司。實驗中涉及的其他白念珠菌菌株和質粒信息見表1。其中，質粒pSN40含有亮氨酸（leucine 2，LEU2）篩選標記，質粒pSN52含有組氨酸（histidine 1，HIS1）篩選標記。

表1 白念珠菌菌株和質粒Tab 1 Candida albicans strains and plasmids

1.1.2 引物 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列及合成片段見表2～4。

表2 敲除引物序列Tab 2 Primer sequences for knockout

表3 鑒定敲除組件的引物序列Tab 3 Primer sequences for identification of knockout components

表4 耐藥基因的引物序列Tab 4 Primer sequences for drug resistance

1.1.3 試 劑 Ex Taq酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、酵母總RNA提取試劑盒（Yeast RNAiso Kit）、RNA反轉錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）、實時熒光定量檢測試劑盒（SYBR Premix Ex Taq Enzyme）等購自日本TaKaRa公司，藥物（FCZ、VRC、ITR）及配置YPD培養基和LB培養基所需蛋白胨、酵母浸液、葡萄糖等購自美國Sigma-Aldrich公司，酵母營養缺陷篩選培養基SD-HIS、SD-LEU和醋酸鋰轉化試劑盒購自北京泛基諾科技有限公司，配置藥敏板的RPMI 1640培養基和3-嗎啉丙磺酸（3-Morpholinopropanesulfonic acid，MOPS）粉末購自美國Gibco公司，柱式質粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司，PCR產物膠回收試劑盒購自美國Axygen公司，無水乙醇、氯仿、異丙醇、酚/氯仿/異戊醇（24:24:1）等購自上海試劑一廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 白念珠菌基因組抽提 參照李文靜等[9]和王影等[10]報道的方法對白念珠菌基因組進行抽提。挑取白念珠菌SN152的單克隆于3 mL YPD培養液，于30 ℃ 180×g振蕩培養16 h，13 000×g離心2 min收集菌體。加入酵母裂解液（10%十二烷基硫酸鈉、0.5 mmol/L pH 8.0 乙二胺四乙酸蛋白酶K）后，水浴65 ℃ 2 h。加入0.5 mL酚/氯仿/異戊醇（24:24:1）混勻，于13 000×g4 ℃離心5 min。吸取上清液轉至新的離心管，加入等體積氯仿，混勻后離心。轉移上清液至新的離心管，加入0.6倍體積異丙醇，充分混勻后離心。棄去上清液，沉淀用0.5 mL 75% 乙醇洗滌并離心。棄上清，室溫下充分干燥，加入50 μL滅菌去離子水溶解。DNA采用超微量分光光度儀（Thermo Nanodrop 2000）進行定量后，-20 ℃保存備用。

1.2.2 質粒轉化與抽提 參照李文靜等[9]和王影等[10]報道的方法進行質粒的轉化與抽提。采用氯化鈣法將質粒pSN40和pSN52轉化至感受態大腸埃希菌DH5α內，將菌液密涂于含氨芐青霉素的LB培養基上于37 ℃過夜孵育。挑取該平板上的單克隆接種于含氨芐青霉素的LB培養液中，37 ℃ 180×g過夜培養，參照柱式質粒DNA小量抽提試劑盒說明書抽提質粒。

1.2.3 構建同源敲除組件 以SN152 菌株DNA為模板，P1/P1'和P3/P3'為引物擴增ERG3基因編碼區上游片段UP-1/UP-2，P4/P4'和P6/P6'擴增下游片段DOWN-1/DOWN-2。以pSN40和pSN52質粒為模板，P2和P5為引物擴增篩選標記LEU和HIS片段（圖1A）。PCR 反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（30 個循環）；72 ℃ 5 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，并根據PCR產物膠回收試劑盒說明書進行純化回收。

以純化后的上述PCR產物[上游片段UP-1/UP-2（50 ng）+篩選標記LEU或HIS片段（150 ng）+下游片段 DOWN-1/DOWN-2（50 ng）]為模板，P1/P1'和 P6/P6'為引物進行融合PCR反應，分別得到同源敲除組件UP-1-LEU-DOWN-1、UP-2-HIS-DOWN-2，前者用以第1拷貝敲除而后者用以第2拷貝敲除（圖1B）。融合PCR反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 50 s，68 ℃ 8 min（30個循環）；68 ℃ 15 min。融合PCR產物經乙醇沉淀法回收，-20 ℃保存備用。融合片段即同源敲除組件送鉑尚生物技術（上海）有限公司測序，并使用DNAMAN軟件進行多重序列比對，證實序列的正確性。

圖1 構建同源敲除組件Fig 1 Construction of homologous knockout fragments

1.2.4 目的基因ERG3敲除株的構建與鑒定 按照醋酸鋰轉染法[11]將第1拷貝敲除組件UP-1-LEU-DOWN-1轉染到SN152菌株。在SD-LEU選擇平板上培養48 h，挑單克隆于YPD培養液中過夜培養，抽提基因組DNA。采用套式PCR鑒定，得到ERG3+/-菌株（圖2）。LEU上下游片段分別位于P1、P3的上游和下游，引物LEU上下游片段位于LEU標記的內部，可鑒定第1拷貝敲除組件是否正確插入目的基因的所在位置（圖3）。經套式PCR鑒定正確的ERG3+/-菌株，用于轉染第2拷貝敲除組件UP-2-HISDOWN-2，菌液密涂于SD-LEU、SD-HIS、SD-LEU-HIS選擇性培養基上，其余步驟及套式PCR鑒定原理同上。引物ERG3-F和ERG3-R用于鑒定目的基因是否被完全敲除。

圖2 運用同源重組技術敲除ERG3基因Fig 2 ERG3 gene knocked out by homologous recombination

圖3 ERG3陽性敲除菌株的鑒定Fig 3 Identification of positive ERG3 gene knockout strains

1.2.5 藥敏試驗 根據美國臨床實驗室標準化委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）M27-A3相關標準，使用微量肉湯稀釋法確定白念珠菌對FCZ、VRC、ITR的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。96孔板中，使得FCZ、VRC、ITR的最高終濃度分別為128、32、16 μg/mL，并依次對倍稀釋。結果判讀參照NCCLS抗真菌藥敏試驗標準，判定敏感（susceptible，S）、中介（intermediate，I）、耐藥（resistance，R）3種結果。FCZ MIC≤8 μg/mL為敏感，MIC=16～32 μg/mL為中介，MIC≥64 μg/mL為耐藥。VRC MIC≤1 μg/mL為敏感，MIC=2 μg/mL為中介，MIC≥4 μg/mL為耐藥。ITR MIC≤0.125 μg/mL為敏感，MIC=0.25～0.5 μg/mL為中介，MIC≥1.0 μg/mL為耐藥。

1.2.6 耐藥相關基因表達水平檢測 按照酵母總RNA提取試劑盒說明書提取SN152、ERG3+/-和ERG3-/-菌株的總RNA。根據反轉錄試劑盒對抽提的總RNA進行去基因組和反轉錄反應，獲得cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq酶試劑盒對3株菌株的cDNA行實時熒光定量PCR（realtime quantitative PCR，qPCR）檢測，反應條件為：95 ℃30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min（40個循環）。溶解曲線反應為：95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s。引物序列見表 4。每個菌株均做復孔，重復3次，以18S RNA為內參基因，應用ABI 7300 SDS軟件系統進行檢測，CT值通過2-△△CT法進行相對基因表達分析。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 7軟件對研究數據進行統計分析。定量資料以±s表示，采用單因素方差分析進行比較。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 ERG3基因缺失菌構建成功

白念珠菌SN152僅能在YPD培養基上生長；第1拷貝敲除株ERG3+/-可在YPD培養基和SD-LEU營養缺陷培養基上生長；雙敲除菌株ERG3-/-在YPD、SD-LEU、SD-HIS和SD-LEU-HIS缺陷培養基上均可生長（圖4）。繼而說明LEU和HIS篩選標記已成功轉入SN152菌株并表達。

圖4 菌株營養型鑒定Fig 4 Identification of nutritional type in strains

為了進一步驗證敲除組件是否正確插入目的基因所在位置，需采用套式PCR進行驗證。利用LEU上下游引物擴增出LEU上下游片段，長度分別為1 009 bp和1 155 bp；利用HIS上下游引物擴增出HIS上下游片段，長度分別為1 214 bp和1 906 bp。經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，各篩選標記已轉入親本菌基因組序列的正確位置，目的條帶與預期一致。ERG3雙敲株的4個鑒定片段（LEU上下游片段、HIS上下游片段）均在預期位置且目的基因ERG3位置無條帶出現；而親本菌SN152只有ERG3片段（454 bp）、無4個鑒定片段（圖5）。由此提示，ERG3基因敲除成功。

圖5 PCR驗證ERG3基因敲除株Fig 5 Identification of ERG3 gene knockout strains by PCR

2.2 ERG3基因敲除對白念珠菌唑類藥物耐藥性的影響

用標準菌株ATCC90028作為對照，比較野生型菌株SN152、單拷貝缺失株（ERG3+/-）、雙拷貝缺失株（ERG3-/-）對唑類藥物敏感性的變化。前述菌株對FCZ、VRC、ITR的MIC值顯示，ERG3+/-株與野生型SN152菌株均表現出對以上3種唑類藥物一致的敏感。ERG3-/-株的MIC值明顯高于ERG3+/-株和SN152菌株；且當ERG3基因被敲除后，白念珠菌對唑類藥物的耐藥性增強，即由敏感轉為耐藥（表5）。

表5 各菌株對FCZ、VRC、ITR的MIC值Tab 5 MIC values of FCZ, VRC and ITR in different Candida albicans strains

2.3 ERG3+/-株耐藥基因水平的變化

在白念珠菌唑類藥物耐藥機制中，除了由ERG3基因編碼的△5,6- 去飽和酶參與的甾醇合成通路改變之外，藥物外排增加和唑類藥物靶酶的改變也是常見原因。介導白念珠菌藥物外排的轉運蛋白家族主要有2類：一種是ABC（ATP-binding cassette）轉運蛋白超家族，其中最重要的是CDR1p（Candida albicansdrug resistance protein 1）和CDR2p，分別由白念珠菌耐藥基因CDR1和CDR2編碼，它們通過水解ATP釋放能量將藥物轉運出細胞[12]；另一種是易化擴散載體超家族（major facilitator superfamily，MFS）， 其 中 MDR1p（multidrug-resistance protein 1）由多藥耐藥基因MDR1編碼，它不依賴于水解ATP的能量，而是通過細胞膜中氫離子的交換達到轉運藥物的目的[13]。此外，14-DM是由ERG11基因編碼產生的唑類藥物的靶酶。若ERG11基因發生突變或者過表達時，將會導致白念珠菌產生耐藥性[14-15]。當ERG11發生突變，會影響14-DM的空間構象，使得藥物與靶酶結合的親合力降低；當ERG11過表達，藥物作用靶酶量增多，導致同等藥量下，未被藥物結合的靶酶量也相應增高，藥物不能達到預期的抗菌效果，從而產生耐藥。因此為了探究ERG3基因敲除是否也與白念珠菌其他耐藥機制相關，故采用qPCR檢測各菌株中前述耐藥基因（CDR1、CDR2、MDR1、ERG11）的表達情況，以SN152作為對照（圖6）。結果顯示，與SN152相比，ERG3+/-株的CDR1（2.05倍）表達上升，但CDR2、MDR1和ERG11無顯著變化；而ERG3-/-株的CDR1（2.63倍）、CDR2（18.47倍）、MDR1（3.72倍）、ERG11（51.71倍）表達均顯著上升，尤以ERG11的上調最為顯著。由此可見，ERG3基因敲除的同時伴隨著其他耐藥基因的高表達。

圖6 各菌株耐藥相關基因的表達Fig 6 Expression of drug resistance-related genes in the three strains

3 討論

基因敲除技術是研究白念珠菌基因功能的重要方法。經典的白念珠菌基因敲除方法為URA-Blaster策略，該方法以基因同源重組為基礎，通過連續2次的hisG-URA3-hisG敲除篩選組件替代靶基因的2個等位基因，從而阻斷靶基因的功能[16-17]。URA-Blaster策略是最早用到營養篩選的白念珠菌基因敲除的方法，但此法需要構建重組質粒，敲除效率低、周期長；而且有研究[18-19]表明，乳清苷5- 磷酸脫羧酶（URA3基因編碼）缺失的白念珠菌生長緩慢，即使在基因敲除過程中可將URA3基因恢復，也同樣會影響菌株的毒力、黏附及形態轉換等性質。2005年Noble等[8]構建了不依賴URA3的HIS1-LEU2-ARG4基因敲除策略，該方法以SN152為親本菌，HIS1、LEU2、ARG4是異源的篩選標記，可任意選擇2個標記進行基因敲除。本實驗所采用的HIS1-LEU2策略回避了URA3對白念珠菌毒力的影響，且具有周期短、轉染效率高等特點[20-21]。此外，Noble等[8]構建的2條基因敲除組件上游和下游同源臂（即UP和DOWN）均為350 bp，存在第1條敲除組件被第2條敲除組件所替換的可能性，導致敲除效率降低。本研究在Noble等[8]的方法基礎上稍加改進，即UP-1為359 bp、DOWN-1為 470 bp、UP-2為 354 bp、DOWN-2為393 bp，第2條敲除組件的上下游同源臂均短于第1條敲除組件的同源臂，因此可有效避免被替換的情況。

白念珠菌是臨床上常見的機會致病性真菌，唑類藥物常作為臨床治療中的一線用藥；然而，近年來白念珠菌對唑類藥物的耐藥性日益嚴重，已成為治療失敗的主要原因之一[22]。白念珠菌對唑類藥物存在多種耐藥機制，其中甾醇合成通路的變化主要是因為△5,6-脫氫酶失活而引起，從而使唑類藥物的作用減弱。Martel等[23]的研究顯示，ERG3的錯義突變可以引起白念珠菌對唑類藥物的高度耐藥性，部分突變菌株甚至在FK506（一種多藥物外排抑制劑）存在的情況下仍體現出唑類耐藥表型。Vale-Silva等[24]在臨床上篩到了一株分離株（VSY2），測序顯示該菌株ERG3雙堿基缺失導致△5,6- 脫氫酶失活，該菌株對唑類藥物具有高耐藥性，缺乏麥角甾醇但絲狀結構正常。由此可見，白念珠菌ERG3的突變或缺失對于其唑類藥物耐藥性有著重要意義。

在本研究中，我們使用同源重組和LEU-HIS標記篩選的方法獲得了白念珠菌ERG3缺失株。ERG3-/-株對3種唑類藥物的MIC值明顯高于親本株SN152和ERG3+/-株，說明只有當ERG3被完全敲除時，白念珠菌對唑類藥物的耐藥性才會升高，ERG3單條基因的缺失不足以引起耐藥性的改變，該耐藥性結果與Luna-Tapia等[25]采用URA-Blaster策略獲得的ERG3缺失株結果一致。此外，我們還發現ERG3基因敲除的同時也伴隨著其他耐藥基因的改變。qPCR結果顯示，ERG3-/-株的CDR1、CDR2、MDR1、ERG11基因表達水平均顯著上升；而ERG3+/-株除了CDR1基因表達有上升外，其余3個耐藥基因未顯示出差異。ERG3-/-和ERG3+/-菌株耐藥基因的結果和藥敏實驗的結果存在一定的一致性。CDR1、CDR2、MDR1是與外排泵編碼相關的基因，這些基因的過表達可導致進入菌體內的藥物外排，細胞內藥物濃度降低從而導致耐藥。而在ERG3-/-株中上升最為顯著的是ERG11（51.71倍），ERG11所編碼的羊毛甾醇14-DM是唑類藥物的作用靶酶，若ERG11基因過表達將會導致菌株耐藥。本研究證實了ERG3-/-株中的外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1和藥物靶酶編碼基因ERG11的高表達，從基因水平提示ERG3基因的缺失除了導致白念珠菌甾醇合成通路改變，或也伴隨著其他耐藥機制的發生。后續可深入檢測ERG3敲除帶來的功能變化，即檢測ERG3-/-株羅丹明6G外排情況和14-DM的活性，從而進一步明確ERG3敲除與菌株藥物外排的能力和藥物靶酶變化的聯系。同時，ERG3基因是如何參與介導白念珠菌對其他唑類藥物耐藥機制也仍待進一步研究。

綜上所述，本研究成功利用同源重組的方法構建了白念珠菌ERG3基因缺失菌，并對其唑類藥物耐藥性之間的關系進行了初步探究，揭示了在白念珠菌中敲除ERG3基因可提高菌株唑類藥物的耐藥性，為進一步研究ERG3基因與白念珠菌多種耐藥機制之間的關系提供了基礎。