人過氧化物氧化還原酶-1在胃癌中的表達情況及其臨床意義

虞 煒 蔡善保

胃癌是全球范圍內發病率第4的惡性腫瘤，其病死率在癌癥相關死亡中排名第2[1]。盡管近些年在胃癌的綜合治療方面取得了一些進展，但胃癌患者的預后仍較差，5年生存率低于25%[2]。此外，大多數患者在確診時已處于中晚期，這也是導致胃癌患者預后不良的重要因素[3]。人過氧化物氧化還原酶-1(peroxiredoxin-1，PRDX1)是過氧化物氧化還原酶蛋白(peroxiredoxin,PRDX)家族成員，其在對抗活性氧簇(reactive oxygen species , ROS)、抗氧化過程中發揮關鍵作用。PRDX1的活性可涉及細胞分化、細胞凋亡和增殖等生物過程，以及可參與多種人類疾病的發生發展[4]。有研究表明，PRDX1可以在不同類型的腫瘤中發揮不同的作用，如在乳腺癌[5]、骨肉瘤[6]中作為抑癌基因發揮作用，也可在胰腺癌[7]、結直腸癌[8]中作為促癌基因發揮作用。但目前為止，PRDX1與胃癌之間的關系尚未明確。本研究首先在mRNA和蛋白水平上檢測胃癌和癌旁組織中PRDX1的表達情況，結合患者臨床病理資料和隨訪資料，評估PRDX1能否成為胃癌的早期診斷及預后評估的新型生物學指標。

1 材料與方法

1.1 材料收集 2018年5月份就診安徽省腫瘤醫院并首次確診的21例胃癌患者的術后胃癌與癌旁組織新鮮標本；同時收集2012年1月至2013年12月在安徽省腫瘤醫院就診并首次確診為胃癌的105例患者術后臨床病理切片及病理學資料，涉及臨床病理的105例患者中有69例男性和36例女性，平均年齡為(68.02±23.71)歲。根據第七版國際抗癌聯盟的TNM分期標準確定腫瘤的病理分期[9]，Ⅰ-Ⅱ期的66例，Ⅲ-Ⅳ期的39例，所有患者術前均未接受過放療或化療。

1.2 實時熒光 定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)用Trizol從21例新鮮胃癌和癌旁組織中提取總RNA，使用cDNA逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。使用SYBR Green定量PCR試劑盒(Bio-Rad)和C1000熱循環儀檢測PRDX1在組織中的mRNA表達水平。PCR引物序列如下：Human PRDX1，正向5’-CCACGGAGATCATTGCTTTCA-3’和反向5’-AGGTGTATTGACCCATGCTAGAT-3’。每個樣品一式三份進行測試，以GAPDH表達作為內參。cDNA逆轉錄試劑盒序列號：RR037A，購于中國大連TaKaRa公司；SYBR Green定量PCR試劑盒序列號：1708880，購于美國加州bio-rad公司。

1.3 蛋白質印跡法 將從新鮮的21例胃癌患者組織中提取的細胞在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)中洗滌后，在4℃以RIPA緩沖液(20 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，10%甘油，50 mM EDTA，1%Triton X-100)裂解30 min。然后收集全細胞提取物并在4℃ 12 000 r/min下離心15 min。之后，用移液槍除去上清液，使用Bradford法檢測蛋白質濃度。通過SDS-PAGE分離等量的裂解物蛋白質并轉移至硝酸纖維素膜。之后，用5%脫脂牛奶封閉膜并在4℃下以PRDX1一抗孵育過夜。第2天，將膜在二抗中孵育，最后通過電化學發光系統顯像。

1.4 免疫組織化學和評分 對從病理科調取的105例胃癌和癌旁組織標本的石蠟切片進行PRDX1免疫組化分析。將胃癌和癌旁組織的蠟塊切片制成4 μm厚的石蠟切片，使用兩步法免疫組織化學技術檢測抗原的表達情況。室溫下將石蠟切片脫蠟脫苯后，在過氧化氫溶液中放15 min以抑制內源性過氧化物酶的活性。用磷酸鹽緩沖液(3次×3 min)洗滌后，在檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中進行抗原修復。再次用PBS(3次×3 min)洗滌后，在室溫下用PRDX1單克隆抗體(Abcam，Cambridge，MA，美國)染色約2 h。然后，用PBS(3次×3 min)再次洗滌。在切片上滴加通用型二抗，后室溫孵育約15 min后，用磷酸鹽緩沖液再洗滌(3次×3 min)。最后，每個切片在室溫下用50 μL DAB顯色液處理約3～10 min，并用顯微鏡觀察，PBS洗滌后，再次以蘇木精復染。最后脫水，封片。

根據細胞的染色強度對每張切片進行評分。根據腫瘤細胞的染色比例評分為0(1%)、1(2%～25%)、2(26%～50%)、3(51%～75%)和4分(≥76%)。根據染色強度評分為0(無染色)、1(弱)、2(中等)和3分(強)。最終表達的結果通過“染色比例百分比得分×強度得分”來確定，總分為12分，0～3分被認為是低表達，4～12分被認為是高表達。所有染色分值的確定由2位病理學專家評估。

2 結果

2.1 PRDX1在胃癌及癌旁組織中表達的比較 在胃癌組織中，qRT-PCR結果顯示PRDX1mRNA表達水平的ΔCT值高于癌旁組織[(5.62±0.42)比(2.16±0.42)，t=14.550、P<0.001]。蛋白質印跡法結果顯示PRDX1在胃癌組織中的蛋白表達水平也高于配對的癌旁組織。見圖1。同時，從調取的105例有隨訪信息和臨床病理學資料的病理切片免疫組化分析結果得出，在大部分胃癌組織中PRDX1蛋白高表達(62/105)。見圖2。

圖1 Western Blot檢測21例胃癌和癌旁組織中PRDX1蛋白表達水平

圖2 免疫組織化學染色檢測PRDX1在胃癌(A)和癌旁組織(B)中的表達情況(免疫組化×10)

2.2 PRDX1蛋白的表達與臨床病理參數的關系對比 胃癌的低未分化與高中分化，T3+T4與T1+T2浸潤深度，有與無淋巴結轉移，及TNM III-IV與Ⅰ～Ⅱ分期，前者PRDX1的蛋白表達水平偏高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3 PRDX1的蛋白表達與預后的關系 Kaplan-Meier生存曲線進一步評估PRDX1的蛋白表達與患者總生存時間(overall survival, OS)及無病生存時間(disease-free survival, DFS)的關系。結果表明，PRDX1的蛋白高表達患者的總生存時間及無病生存時間均低于PRDX1的蛋白低表達的患者。見圖3。

表1 PRDX1在胃癌中的表達與胃癌患者的臨床參數之間的關系(例)

圖3 Kaplan-Meier生存曲線分析105例胃癌患者的OS和DFS與PRDX1的蛋白表達情況的關系

2.4 早期胃癌患者淋巴結轉移影響因素的多因素分析 將患者總生存時間、無病生存時間作為因變量，患者性別(男性=0，女性=1)、年齡(21～60歲=0，60～85歲=1)、腫瘤大小(0.3～5.0=0，5.1～9.0=1)、腫瘤分化程度(高中分化=0，低未分化=1)、淋巴結轉移(無=0，有=1)、浸潤深度(T1+T2=0，T3+T4=1)、TNM分期(I-II=0，III-IV=1)、PRDX1 的蛋白表達(高=0，低=1)作為自變量納入COX回歸分析，統計過程中篩選變量的方式是Forward: LR法，COX單因素分析顯示，腫瘤分化程度(OS：P=0.001，DFS：P=0.003)、浸潤深度(OS：P=0.021，DFS：P=0.030)、淋巴結轉移(OS：P= 0.006，DFS：P=0.001)、TNM分期(OS：P<0.001，DFS：P<0.001)及PRDX1的蛋白表達(OS：P=0.014，DFS：P=0.006)與胃癌患者的總生存時間和無病生存時間相關；COX多因素分析顯示，PRDX1的蛋白高表達(OS：P<0.001，DFS：P=0.017)、TNM分期(OS：P<0.001，DFS：P=0.004)為胃癌患者總生存時間和無病生存時間的獨立預后影響因子。見表2、3。

表2 COX單因素和多因素分析患者臨床病理參數與總生存時間的相關性

表3 Cox單因素和多因素分析患者臨床病理參數與無病生存時間的相關性

3 討論

篩選胃癌診斷的分子標志物并能明確其在腫瘤發生發展中的作用乃至機制是極其重要的。因此，本課題組希望能尋找到胃癌的早期診斷標志物，并能對預后判斷有一定的指導意義。

PRDX1是以抗氧化酶的作用被發現的，其對氧化應激非常敏感，在應激條件下可從過氧化物酶轉化為分子伴侶[10]。最近有研究[11]表明，PRDX1的表達與人類腫瘤的發生發展密切相關。PRDX1基因位于1q34.1染色體上，而1q染色體的雜合性缺失已經被證實參與腫瘤的進展[12-13]。除了抗氧化物酶和分子伴侶功能，PRDX1還可增強自然殺傷細胞的細胞毒性，并抑制致癌蛋白，如c-Myc和c-Abl等的表達。PRDX1還可以通過結合磷酸酶及張力蛋白同源物基因( phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)促進PTEN的腫瘤抑制作用，并保護其脂質磷酸酶活性免受H2O2誘導失活[14]。實驗[15]證明，缺乏PRDX1的小鼠會出現嚴重的溶血性貧血和各種類型的惡性腫瘤，這表明PRDX1可作為腫瘤抑制因子發揮作用。但迄今為止，PRDX1在胃癌中的表達及作用尚未被報道。

本研究了解到PRDX1在胃癌組織中的蛋白表達水平明顯高于癌旁組織，且表達評分與患者的臨床病理特征具有明顯的相關性，PRDX1蛋白高表達患者胃癌細胞分化程度越低且病期越晚，淋巴結轉移發生率越高。此外，生存分析顯示：PRDX1蛋白高表達患者的總生存時間及無病生存時間均顯著低于PRDX1蛋白低表達的患者。有研究[16]證明，PRDX1在大多數的腫瘤中高表達，并且PRDX1蛋白水平的高表達通常伴隨著較差的預后。有學者[17]報道，PRDX1在少突神經膠質瘤中高甲基化，敲除PRDX1可顯著促進細胞凋亡，降低Hs683膠質瘤細胞受到放療或使用替莫唑胺化療的存活率。PRDX1還可以通過刺激絲裂原活化蛋白激酶5(mitogen-activated protein kinase-5，MKP-5)活性來避免活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導的乳腺癌細胞的衰老[18]。Jiang等[19]報道，肺癌患者腫瘤組織中PRDX1的表達水平高，并且PRDX1的高表達可能與肺癌患者的淋巴結轉移和腫瘤分化程度有關，且在肺癌發生發展過程中，血漿中PRDX1水平通常也較高，認為可以將PRDX1作為肺癌的生物學標志物。

綜上，筆者推測PRDX1可作為胃癌診斷和預后的特異性標志物。但就目前來看，PRDX1在胃癌中的病理生理作用尚未被揭示，接下來擬進一步研究PRDX1在胃癌發生發展中的具體分子機制。