響應面法優化生物酶法制備環氧蓖麻油

萬謙，何鑫，許小玲，薄廣旭，閆云君，

(1.華中科技大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學 中歐清潔與可再生能源學院，湖北 武漢 430074)

蓖麻油作為一類非食用油，具有分子結構特殊[1]及脂肪酸組成單一(蓖麻油酸甘油酯質量分數在80%以上[2])的優勢。以蓖麻油為原料制備環氧蓖麻油不僅可用于制備植物油基多元醇替代石油聚醚多元醇生產聚氨酯[3]，還可作為原料用于制備涂料[4]、增塑劑[5]、油墨[6]及潤滑油[7]等，其特殊的組成及結構使其擁有比環氧大豆油或環氧菜籽油更大的應用前景[8]。當前，蓖麻油已在我國實現了規模化種植[9]，其產量也在逐年攀升，有望在未來成為主流生物質化工原料[10-11]。

化學法制備環氧植物油存在產物轉化率低[12-13]、副反應多、腐蝕性強[14]及污染嚴重[15-16]等缺點。而生物酶法不僅反應條件溫和，反應選擇特異性好、轉化率高，且生產工藝簡單，后處理容易[17-18]。本文以蓖麻油為研究對象，在甲苯體系中以Novozyme435為催化劑，以生物酶法制備了環氧蓖麻油，并確定了最優制備條件。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

脂肪酶Novozyme 435(10 000 U/g，酶活)，購自北京高瑞森科技有限公司；蓖麻油(82～90 g I2/100 g，碘值)購自廣州市東辰化工有限公司；蓖麻油酸(純度≥98%)由河北省阜城縣環宇油脂有限公司提供；雙氧水(30%，ω/ω)、甲苯、碘化鉀、淀粉、硫代硫酸鈉、一氯化碘、冰乙酸、環己烷、KOH、NaOH、鄰苯二甲酸氫鉀、鹽酸、丙酮、NaHCO3等均為分析純。

THZ-82水浴恒溫振蕩器；RE-52AA旋轉蒸發儀；7890A/5975C氣質聯用儀；Bruker Vertex70 FTIR型光譜儀；Bruker Ascend TM 600 MHZ型核磁共振波譜儀等。

1.2 原料性質分析

將蓖麻油進行氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)分析，色譜圖見圖1，蓖麻油主要組分及含量見表1。

表1 蓖麻油的主要組分及含量

由表1可知，原料油中的主要成分為蓖麻油酸甘油三酯，其質量分數達86.16%。其他成分如棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸以及二十碳烯酸含量均較少。總的不飽和脂肪酸含量累計達93.39%，說明原料油不飽和程度高，環氧轉化空間大。依據GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》，測定蓖麻油的酸值為13.8 mgKOH/g；依據GB/T 5532—2008《動植物油脂碘值的測定》，測得的蓖麻油碘值為88.86 g/100 g。

1.3 實驗方法

1.3.1 蓖麻油環氧化過程 蓖麻油在脂肪酶Novozyme435的催化作用下，與過氧化氫發生過氧化反應生成環氧蓖麻油，具體實驗步驟如下。

取250 mL具塞錐形瓶，按順序依次向其中加入10 g蓖麻油、一定量的蓖麻油酸、30%濃度的雙氧水、有機溶劑、催化劑Novozyme435，然后將250 mL錐形瓶放入轉速為225 r/min的水浴恒溫振蕩器中反應。反應后產物用100 mL質量分數為2.5%的碳酸氫鈉堿洗，接著用蒸餾水洗至中性，收集上層油液，減壓旋蒸得到淡黃色油狀液體即為環氧蓖麻油。其反應機理見圖2。

圖2 Novozyme435催化蓖麻油環氧的反應過程

1.3.2 環氧蓖麻油酸值與環氧值測定 依據GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》測定蓖麻油的酸值，依據GB/T 1677—2008《增塑劑環氧值的測定》測定環氧蓖麻油的環氧值，實際環氧值計算依據公式(1)，理論最大環氧值計算則為公式(2)。

實際環氧值X1(mol/100 g)可以通過式(1)計算(各字母含義參考國標GB/T 1677—2008)。

(1)

理論最大環氧值X(mol/100 g)可以通過式(2)計算。

(2)

其中，IV0為實際測得的蓖麻油原料碘值(88.86 g/100 g)，Ai為I原子的摩爾質量(126.9 g/mol)，A0為O原子的摩爾質量(16.0 g/mol)；環氧轉化率為X1/X(%)。

1.3.3 蓖麻油和環氧蓖麻油的紅外(FTIR)表征 采用紅外光譜儀對蓖麻油(CO)和環氧蓖麻油(ECO)結構進行表征，波長記錄范圍在4 000～400 cm-1之間。

1.3.4 蓖麻油和環氧蓖麻油的核磁氫譜(1H NMR)表征 采用核磁共振波譜儀對蓖麻油(CO)和環氧蓖麻油(ECO)結構進行分析，CDCl3為溶劑，TMS為內標。

2 結果與討論

2.1 單因素條件優化

2.1.1 反應溫度對環氧蓖麻油環氧值的影響 取10 g蓖麻油，控制過氧化氫與蓖麻油雙鍵摩爾比為2∶1，反應時間為24 h，Novozyme435催化劑添加量為4%(質量分數)、搖床轉速為225 r/min、蓖麻油酸添加量為8%(質量分數)以及甲苯添加量為110%(質量分數)，研究反應溫度對所得產物的環氧值的影響，結果見圖3。

圖3 反應溫度對環氧蓖麻油環氧值的影響

反應溫度是影響反應速率的重要因素。一般來說，溫度越高，分子運動越劇烈，反應物發生碰撞的幾率越高，意味著酶與反應底物接觸的頻率越高，反應速率越快。但酶是一種具有生物活性的催化劑，其對溫度耐受性是有限的，一旦溫度超過閾值，酶就會失活，從而失去催化活性，所以只有選擇合適溫度，才能獲得最大的酶促反應速率。由圖3可知，當溫度為40 ℃時，得到的環氧蓖麻油具有最大的環氧值。當溫度低于40 ℃時，分子運動不夠劇烈，底物與酶碰撞頻率較低，不利于反應速率的提高；當溫度高于40 ℃時，溫度過高，酶的活性受到抑制，即使底物與酶的碰撞頻率提高，活性顯著降低的酶也無法有效提高反應速率。因此，固定化脂肪酶Novozyme435催化雙氧水與蓖麻油反應制備環氧蓖麻油的最適反應溫度確定為40 ℃。

2.1.2 反應時間對ECO環氧值的影響 按照上述反應條件，研究反應時間對所得產物環氧值的影響，結果見圖4。

由圖4可知，當反應時間為18 h時，得到的環氧蓖麻油具有最大環氧值。當反應時間為3～6 h時，環氧值升高最快，此時反應速率最大，原因在于此時反應底物的濃度是最高的。當反應時間為6～18 h時，產物環氧值的升高幅度開始減緩，反應速率逐漸下降，原因是隨著反應的進行，反應底物的濃度開始逐步降低。當反應時間超過18 h，得到的環氧蓖麻油的環氧值呈現下降的趨勢。其原因為：反應時間的延長會導致Novozyme435催化環氧基團開環聚合的反應不斷加深，致使最終產物環氧值的降低。在實際操作中發現，隨著時間的推移已合成的環氧蓖麻油會逐漸產生白色沉淀，在把旋蒸后的成品放置在60 ℃烘箱中過夜之后，這種情況就消失了(滅活殘留的酶)。因此，最適反應時間確定為18 h。

圖4 反應時間對環氧蓖麻油環氧值的影響

2.1.3 過氧化氫與蓖麻油雙鍵的摩爾比對ECO環氧值的影響 按照上述反應條件，研究過氧化氫與蓖麻油雙鍵的摩爾比對所得產物環氧值的影響，結果見圖5。

圖5 過氧化氫與蓖麻油雙鍵的摩爾比對環氧蓖麻油環氧值的影響

由圖5可知，當過氧化氫與蓖麻油中雙鍵的摩爾比為2∶1時，得到的環氧蓖麻油具有最大環氧值。當過氧化氫與蓖麻油中雙鍵的摩爾比低于2∶1時，反應底物雙氧水的濃度較低，酶與底物的有效碰撞頻率也較低，反應速率較慢；當過氧化氫與蓖麻油中雙鍵的摩爾比高于2∶1時，過氧化氫濃度過大，對脂肪酶的毒害作用加劇，導致酶活性降低，反應速率亦降低。只有取二者的平衡點過氧化氫與環氧蓖麻油中雙鍵摩爾比為2∶1時，才能獲得最佳效果。

2.1.4 蓖麻油酸添加量對ECO環氧值的影響 按照上述反應條件，研究蓖麻油酸添加量對所得產物環氧值的影響，結果見圖6。

圖6 蓖麻油酸添加量對環氧蓖麻油環氧值的影響

2.1.5 甲苯添加量對ECO環氧值的影響 按照上述反應條件，研究甲苯添加量對所得產物環氧值的影響，結果見圖7。

圖7 甲苯添加量對環氧蓖麻油環氧值的影響

由圖7可知，當甲苯添加量為40%時，得到的環氧蓖麻油具有最大環氧值。甲苯作為反應體系的有機溶劑，一方面可以有效降低反應體系的粘度，使催化劑免于被裹附的困境；另一方面可以增加過氧化氫在反應體系中的濃度(過氧化氫在非極性溶劑中的溶解度大于其在水中的溶解度[17]，而水的極性大于甲苯的極性)。當甲苯添加量低于40%時，反應體系的粘度過大，過氧化氫濃度不高，導致反應速率低，產物的環氧值也不高。當甲苯添加量高于40%時，甲苯溶劑添加量過大，稀釋了過氧化氫的濃度，導致反應速率降低，產物的環氧值下降。綜上，甲苯添加量為40%時，才能獲得最佳效果。

2.1.6 催化劑添加量對ECO環氧值的影響 按照上述反應條件，研究催化劑Novozyme435添加量對所得產物環氧值的影響，結果見圖8。

圖8 催化劑添加量對環氧蓖麻油環氧值的影響

由圖8可知，隨著催化劑Novozyme435添加量的逐漸提高，得到的環氧蓖麻油環氧值逐漸趨平。當催化劑添加量過少，其濃度較低，酶促反應速率也較低，最終導致產物環氧值不高。當催化劑添加量逐步升高時，最終產物的環氧值緩慢提高直至趨于平緩，但并未出現峰值。出于經濟效益考慮，最終選取催化劑Novozyme435添加量為4%。

2.2 響應面優化

2.2.1 響應面實驗結果與分析 在單因素條件優化基礎上，確定影響環氧蓖麻油環氧值的3個主要因素分別為甲苯添加量、催化劑添加量、反應溫度。根據Box-Behnken模型設計響應面優化方案，設計方案見表2。

根據3因素3水平的設計方案，SAS 9.2自動生成15組實驗。以產物環氧值作為響應值，分析處理結果見表3。對數據進行建模，擬合得到3種因素對產物環氧值影響的二次回歸方程式：

Y1=-7.208 19+0.409 623X1+0.385 74X2+0.132 09X3-0.005 327X12+0.010 005X1X2-0.000 246X1X3-0.089 939X22+0.001 979X2X3- 0.001 523X32

(3)

為對二次回歸方程的擬合效果進行進一步檢驗，需對回歸方程進行方差分析，分析結果見表4。一般用顯著性水平α來檢驗系統的隨機誤差，當Pr>F的概率<0.05時，則認為模型顯著。表4中回歸模型(Model)的Pr>F的值<0.000 1，說明回歸模型為極顯著模型。失擬項的Pr>F的值為0.135 1，說明失擬檢驗不顯著，模型誤差較小。因此，二次回歸方程可以有效模擬不同條件下環氧蓖麻油的環氧值，擬合度良好。

另外，回歸方程的多重相關系數R2=99.24%，說明該反應條件下合成的環氧蓖麻油的實際環氧值與通過回歸方程算得的值十分接近。同時，X2的一次項和二次項的Pr>F的值均<0.000 1，這說明催化劑Novozyme435的添加量對產物的環氧值影響是極顯著的。

表4 回歸方程方差分析

2.2.2 響應面實驗結果的驗證 圖9展示了3因素3水平經響應面優化后得到的平面等高線圖和立體響應面圖。

a.X2X3響應面圖 b.X1X3響應面圖 c.X1X2響應面圖

d.X2X3等高線圖 e.X1X3等高線圖 f.X1X2等高線圖

由圖9可知，此模型存在頂點，軟件分析處理后給出頂點對應參數，即為反應的最優條件：甲苯質量分數為43.19%，催化劑Novozyme435質量分數為4.96%，反應溫度為42.1 ℃，在此條件下模型預測的函數值Y1為5.23%(即環氧值)。

為驗證回歸模型的可靠性，須在最優反應條件下(甲苯用量43.19%、催化劑用量4.96%、反應溫度42.1 ℃)合成環氧蓖麻油(設置2組平行)，并將最后得到的環氧蓖麻油環氧值與模型預測值比較。最后得到環氧蓖麻油的環氧值Y1為(5.20±0.19)%[根據公式(1)計算得環氧轉化率為97.93%]，與預測值5.23%極為接近，表明回歸模型可靠。

2.3 紅外(FTIR)表征

為進一步確定環氧蓖麻油的生成，對蓖麻油(CO)和環氧蓖麻油(ECO)進行紅外表征，其紅外圖譜見圖10。

圖10 蓖麻油與環氧蓖麻油的紅外圖譜

2.4 核磁氫譜(1H NMR)表征

為進一步確定環氧蓖麻油的生成，對蓖麻油(CO)和環氧蓖麻油(ECO)也進行了核磁表征，其核磁氫譜見圖11。

圖11 蓖麻油和環氧蓖麻油核磁共振氫譜

3 結論

與化學法相比，以脂肪酶Novozyme435為催化劑的生物酶法在植物油的環氧化上具有更高的選擇特異性，產物的環氧轉化率更高，副產物更少。同時，研究發現在生物酶法催化蓖麻油的環氧化過程中，游離脂肪酸是不可或缺的，其擁有載氧劑功能。催化劑Novozyme435的添加量對產物環氧值的影響是極顯著的，得到的反應最優條件為：甲苯用量43.19%，催化劑Novozyme435用量4.96%，反應溫度42.1 ℃，過氧化氫與蓖麻油雙鍵摩爾比2∶1，蓖麻油酸用量8%及反應時間18 h，環氧蓖麻油最大環氧值達5.20%，環氧轉化率達97.93%。