獸藥檢測技術研究進展

文│劉妍璨 劉智 代躍灃（云南省昭通市畜牧獸醫技術推廣站）

近年來，由于假冒獸藥技術越來越先進，同時也越來越復雜，假冒獸藥產品和不合格產品呈現上升趨勢。某些偽造假冒的獸藥產品質量可能符合獸藥典規范的要求，也就是說，它們的有效成分含量是符合標準的。世界衛生組織（WHO）將假冒藥品定義為故意在身份或者來源方面貼錯標簽的藥品，假冒產品既可能是品牌產品，也可能是假冒偽劣產品，包括：具有有效成分或者其他成分的藥品；不含有效成分或者含量不足的偽劣產品；仿冒的假冒產品。盡管某些假冒獸藥包含正確的有效成分，但在制造過程中未遵循生產規范（GMP）和其他規范，存在安全隱患。在需要使用抗菌藥物時，使用抗菌藥物含量較低的假冒偽劣藥品，會因為亞治療劑量而使微生物產生耐藥性。

當前識別假冒獸藥的方法主要包括視覺分析和化學分析。藥品和包裝中包含的防偽標志可用于視覺分析。一些公司建議使用特殊的墨水和印刷技術將獨特的設計、編號或圖標直接壓印到產品上。美國食品藥品監督管理局（FDA）開發并使用了一種便攜式技術，該技術基于使用多波長光源對假冒產品進行可視化分析?；瘜W分析方法包括比色法、液相色譜—質譜、近紅外光譜、近紅外化學成像、中紅外光譜、拉曼光譜、X射線熒光、X射線粉末衍射、離子遷移譜和同位素比質譜。然而，這些分析方法中有些比較費時或準確度不高。

在本篇綜述中，筆者重點介紹了幾種快速檢測藥物的技術，這些技術最近已被報道用于假冒偽劣獸藥的定性和定量。此外，討論了假冒偽劣獸藥的一些新特性，并給出了處理此類假冒產品的幾個示例。

一、光譜法

1.近紅外光譜。近紅外光譜（NIRS）是一種快速且準確率高的技術，可對幾乎任何基質進行多成分分析。它覆蓋了與中紅外光相鄰的波長范圍，并一直延伸到可見光區域。盡管在20世紀20年代初進行了許多NIRS實驗，但直到20世紀60年代中后期才實際使用NIRS。近年來，NIRS已在制藥行業中被廣泛接受，用于原料測試、產品質量控制和過程監控。由于NIRS與其他分析技術相比，主要優勢是無須任何預處理即可輕松進行樣品快速分析，NIRS已被用作一種防偽分析方法。Scafi等人通過使用NIRS，建立了相對簡單的協議，并采用了化學計量學方法（主要成分分析和比對的軟獨立模型），以此來識別假冒藥品。他們評估了與使用NIRS進行藥物識別有關的主要缺點，例如濕度變化，樣品位置和樣品表面（用于片劑）。此外，他們提出一種簡單的方案，并做了驗證，可以使用已知的假冒藥品來做成對比檢測的可靠模型。Olsen等人使用百憂解作為模型藥物來證明NIRS在篩查假冒藥物方面的靈活性。Vredenbregt等人描述了一種使用NIRS的快速篩選方法，用于檢測假冒仿制西地那芬的產品，從形狀、顏色看起來像西地那芬的未知樣品中，他們開發出的方法很容易將44個樣品鑒定為假藥。

在國內，為了快速檢測出偽劣假冒藥品，相關部門正在研究開發移動實驗室，主要用于藥物篩查測試領域。正在開發包括安裝在移動車輛中的NIRS測試系統的“快速藥物識別系統”。Feng等人選擇了來自不同制造商的羅紅霉素片和紅霉素乙基琥珀酸酯片構建通用定量模型（可用于測試具有相同含量和相同規格但來自不同制造商的藥物產品的模型），以用于NIRS預篩選系統的示例，模型具有良好的特異性及線性，準確性和重復性高。此外，它們無須任何特殊的數學處理即可直接用于同一品牌的不同光譜儀中。近年來，中醫研究人員對NIRS的熱度不減。該技術可用于中藥的藥用種類鑒定、分類、來源分析以及摻假檢測等。

2.近紅外化學成像。近紅外化學成像（NIR-CI）結合了經典光譜技術，能夠提供有關藥品成分的空間化學結構信息。因此，NIR-CI已成功應用于藥物鑒定和量化，也可用于測定制造工藝對藥品的影響，以及評估藥品的均勻性。Dubois和Wolff等人已使用NIR-CI來鑒定假冒藥品。Puchert等人提出了一個新的四階段概念，用于可靠地識別與真實產品非常相似的假冒獸藥。他們發現，對于偽造品鑒定，NIR-CI優于單點NIRS，因為它結合了光譜學的功能和可視化的潛力，從而可以對化學成分、域結構和化學結構進行局部表征。Lopes等人采用NIR-CI來研究未知來源的仿冒片的成分，得出的結論是，在不了解片劑的任何信息且不破壞片劑的情況下，NIR-CI能夠在空間上鑒定和量化假冒片劑研究中的主要化合物。

3.拉曼光譜。拉曼光譜法是利用非彈性散射光獲得樣品的光譜“指紋”，然后可以根據峰的位置和強度來鑒定組分及其相對濃度。像NIRS一樣，拉曼光譜儀作為便攜式設備已被證明在現場鑒定和偽造品檢測上很成功。無須任何樣品前處理，拉曼光譜儀就可以透過包裝進行無創性和非破壞性篩查。隨著這種光譜技術的發展，便攜式拉曼光譜變得越來越流行。

Noonan等人研究一種檢測的通用模型，該模型可以在三種制劑存在的情況下對多種目標藥物進行分類，其中某些化學成分與目標藥物非常相似。在開發的模型基礎上，他們能夠成功地將相似的藥物進行快速分類，并詳細介紹了如何使用自制的手持式商用儀器來采集光譜，以及在模型開發之前對所需光譜進行預處理。Loethen等人使用了一種方法，該方法僅使用藥物有效成分的拉曼光譜作為參考庫，就可以在廣泛的抗感染類藥物中快速完成仿照品的篩選。申炳俊等人已經開發了一種使用便攜式拉曼光譜儀的方法，可無損地篩選人血清白蛋白注射劑。Lawson和Rodriguez提出了一種使用拉曼光譜法篩選抗生素和抗病毒藥物成品的新算法，該方法引入了二進制條形碼比較方法來識別藥品中的有效成分，結果表明，該方法可以正確預測18種不同商業藥品和9種模仿假冒藥品。

4.X 射線熒光。X 射線熒光（XRF）是確定物質中微量元素的種類和含量的一種技術。該技術具有多元素分析能力強、靈敏度高、精度高、分析時間短等優點，并且無損檢測。這些功能使其適合檢測各類獸藥，是一種出色的分析方法，可用于測定有效成分、涂層劑和賦形劑，例如磷酸鈣、氧化鈦和氧化鐵，所有這些輔料都可以通過XRF直接在表面上進行檢測。Ortizaet等研究人員從XRF數據中提取獲得了多個商業樣品和假冒樣品的無機化學指紋，并使用化學計量學方法將所研究的藥片歸類為真品或偽造品。因此，XRF為有效成分和賦形劑的半定量測定提供了一種極好的分析方法。

5.X射線衍射。粉末X射線衍射（PXRD）在制藥工業中通常用于中間產品藥物有效成分的多晶型鑒定，但不適用于最終產品。Maurin等人展示了對真實和假冒西地那芬的分析結果，顯示了輔料及其丸芯的差異，除了去除外包裝外，藥物未進行任何事先處理，從西地那芬制假樣品獲得的結果表明，X射線粉末衍射，特別是在使用新型快速衍射技術（包括多層鏡和位置敏感計數器）非常適合用于獸藥市場對假藥的篩查控制。有研究表明一種基于微X射線衍射的防偽方法，使用掃描的X射線束還可以讀取條形碼和商標，其分辨率可達到0.30毫米，可以通過X射線衍射讀取。已獲批文的獸藥（包括氟苯尼考和頭孢噻呋）條形碼和商標印在各種基材上證明了X射線衍射方法是非破壞性的、自動化的且人性化的，可用于通過印在制劑包衣上或包裝上的隱藏圖案來驗證藥物制劑的真實性。

6.紅外光譜。Anzanello等人提出了一種方法，用衰減全反射傅立葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）波數子集，鑒別兩個獸藥制劑樣本，其中一個為真品另一個為假冒產品，該方法首先將多元技術PCA應用于ATRFTIR數據，并且從PCA提供的參數中得到可辨真偽的重要性指數。

二、色譜方法

色譜方法不僅可以用于實驗室，而且可以用于快速檢測假冒獸藥或者是獸藥中的非法添加。朱俐等人開發了一種在20分鐘內快速測定14種獸藥抗生素的高效液相色譜（HPLC）方法，該方法使用二極管陣列檢測器和C18或C8色譜柱，通過該方法僅需少量參考標準品即可進行定量分析。有研究報道，一種新開發的低成本毛細管電泳（CE）儀器進行定性定量分析，在他們的試驗中，對已知假冒抗菌、抗寄生蟲獸藥等有針對性的藥理學類別進行了完整的驗證研究。盡管有高效而又有針對性的定性定量色譜技術，如HPLC、CE等，但是樣品前處理可能會很耗時，常用幾種樣品前處理技術包括固相萃取、固相微萃取、液相微萃取、微波輔助萃取和超聲輔助萃取等。

三、質譜

1.同位素比質譜。同位素比質譜儀（EA-IRMS）是用于測量批量樣品中穩定同位素量比的常規儀器，它已廣泛用于現實研究，以建立追溯食品藥品來源的方法。碳和氮的測量可提供有關植物類型日糧的信息，而氫、氧和硫的數據可提供可靠的環境和地理信息。Jasper等人研究發現使用IRMS進行有效成分定量研究，在這項研究中，選擇了含有四種有效成分的20個盲樣，并測量了碳、氮、氧或氫元素的同位素含量比。

Benson和Carter等人總結了同位素比數據在分析假冒獸藥中的用途。Fernandez等人對80批次的生鮮牛奶中抗生素和激素殘留進行了廣泛研究。由于牛奶的激素及抗生素包含碳、氮和硫元素，因此通過多收集器電感耦合等離子體質譜（MC-ICP-MS）和EA-IRMS對這些元素的同位素量比測量進行了分析。結果表明，兩種方法的結合具有檢測仿冒藥品的巨大潛力。此外，這種方法可以使將兩個假冒批次聯系起來，查到共有的源頭，或者在生產一系列假冒獸藥的嫌疑人與負責生產假冒獸藥制劑的實驗室之間建立聯系。

2.離子遷移質譜。離子遷移譜（IMS）是一種分析技術，可根據其離子遷移率將氣相離子分離，這與分子結構、大小和形狀有關，類似于凝聚相中的電泳。長期以來，該技術一直用于檢測藥品中非法添加物質。最初，離子遷移譜儀僅用于物理化學領域和等離子體物理研究。在20世紀80年代后期，基質輔助激光解吸和電離（MALDI）和電噴霧電離（ESI）方法的發展使IMS能夠測量大型生物分子，使得20世紀90年代離子淌度質譜（IM-MS）領域有了重大突破。Gryniewiczet等人發現IMS是通過西地那非、他達拉非等5種已知類似物摻假藥進行分析，建立了有用的快速篩選方法。芒斯等人擴展了IMS的檢測范圍，包括以前未經測試的西地那非類似物和最近批準的阿伐那非，研究表明，IMS可以用作一種快速篩選工具，用于檢測有效成分總的摻雜物。Krueger等人使用高性能離子遷移譜儀對營養補充劑進行快速分析。哈里斯等人應用漂移管離子遷移譜法（DTIMS）結合激光燒蝕/解吸電噴霧電離（LADESI）來對現場收集的抗瘧藥物片劑進行指紋識別，LADESI平臺提供了用于識別藥物有效成分的獨特光譜功能。

離子淌度質譜（IM-MS）是一種強大的分析技術，結合了傳統上與IMS和MS相關的優勢。IM-MS已應用于糖、肽、脂質、蛋白質、核苷酸以及其代謝產物的測定。它可以用于增強化學和生物物理分析的各個領域。Cuyckenset等人專注于研究IM-MS，它與體內電荷狀態過濾和各種現有軟件工具結合使用，用于在體內基質存在下提取和鑒定肽類藥物的代謝產物的離子。Blackburn等人在動物血漿中二苯胺堿的生物分析中引入了波形遷移率光譜法（FAIMS）。盡管到目前為止，只有少數報道通過IM-MS快速檢測假冒獸藥，但是這種強大的技術很可能在將來變得流行。

3.氣相色譜—質譜。氣相色譜—質譜（GC-MS）是定性和定量藥物中未知摻雜物靈敏有效的技術，它可以應用于中獸藥摻假化藥的檢測。朱小紅等人開發了GC-MS方法來檢測獸用中藥中的非法添加化藥。

4 . 其他質譜檢測技術。Fernandez等人通過解吸電噴霧電離（DESI）和實時直接分析（DART）結合飛行時間質譜對假冒獸藥進行了分析研究，他們證明了DART在快速篩查假冒抗瘧疾藥物，篩查出青蒿琥酯幾種不同假冒產品的實用性，這些假冒產品中有些含有其他無效成分，一個假冒品含有青蒿琥酯，但僅占規定含量的20%，這對瘧疾控制具有重要意義，因為使用低劑量青蒿琥酯可能導致瘧疾寄生蟲中出現青蒿琥酯耐藥性，從而使青蒿琥酯無效。

四、結論

隨著假冒技術的不斷發展，假冒獸藥已成為正規獸藥行業及畜禽養殖業主要威脅。特別是在發展中國家，假冒偽劣、非法添加獸藥的新特性發展趨勢日益復雜，包括：符合《獸藥典》的產品（即假冒獸藥產品可以通過指定檢測）；將化學藥品摻入傳統中藥中；使用回收的正規包裝的假冒獸藥。為了應對復雜且不斷變化的情況，僅使用一種檢測技術是無法獲得令人滿意的結果。

某假冒疫苗在流動實驗室中進行了測試。通過視覺分析，包裝盒、上部密封貼紙、裝有藥物的瓶子是真實的。但是，在紫外光和目視檢查下發現，下部密封膠、塑料蓋和鋁蓋是偽造的。通過NIRS和HPLC-MS進行了進一步測試，證明該疫苗為假冒疫苗。通過這種檢測技術的組合，可以快速正確地識別出假冒疫苗。

光譜方法，特別是NIRS，在檢測假藥中非常實用。經過10 年的實施，我國逐步開發了快速的NIRS藥物篩選系統，已成為NIRS在國內應用的主要平臺。通過快速初步篩選鑒定出可疑藥物后，可通過HPLC或LC-MS進行進一步分析以進行驗證。通常，本文中介紹的所有檢測技術均采用數據庫比較。通過將測試結果與相關數據庫進行比較，可以實現快速分析，這些數據庫的廣泛共享和應用將加速快速檢測技術的實施，獸藥監管體系也可借鑒此模式，使獸藥監管更加高效準確。