基于ISSR的野生和栽培的褐苞薯蕷遺傳多樣性分析＊

曾昭清，高慧新，朱 華，田 慧

（1. 廣西中醫藥大學藥學院 南寧 530002）

褐苞薯蕷（Dioscorea persimilis Prain et Burkill），藥材名為廣山藥，為薯蕷科薯蕷屬植物，別名廣西壯族自治區（以下簡稱“廣西”）淮山，淮山藥，山板薯，分布在海拔100-1950 m 的山坡、路旁、山谷雜木林或灌叢中。我國南方各地有栽培，主產于廣西陸川、玉林、桂平、平南、靈山[1]。褐苞薯蕷是廣西的道地藥材，根莖入藥，其性味甘、平，具有“補脾養胃，生津益肺，補腎澀精”的功效，用于脾虛食少，久瀉，脾虛咳喘，腎虛遺精，帶下，尿頻，虛熱消渴等癥。此外，該藥也被《廣西壯族自治區壯藥質量標準》收載，其性味甜、平，具有“調谷道氣道水道，補肺腎”的功效，用于埃病（咳嗽），啊肉甜（消渴）等癥[2]。

ISSR（inter-simple sequence repeat）即簡單重復序列，具有多態性高、重復高、穩定性好、操作方便及成本低等優點[3，4]。近年來ISSR 分子標記技術被廣泛應用于品種鑒定和親緣關系分析、系統發育遺傳多樣性的分析和與目標基因連鎖的ISSR 標記輔助育種等方面。張盾等[5]在對野生山莨菪遺傳多樣性進行研究，采用ISSR 分子標記法，研究結果表明：野生山莨菪居群之間具有較高的遺傳多樣性，各居群間遺傳距離與地理距離顯著相關。中藥的野生品與栽培品之間質量多有不同，對臨床療效有影響。王飛等[6]比較分析了栽培山藥和野生山藥的營養品質，研究表明栽培山藥營養品質優于野生山藥，而關于野生和栽培褐苞薯蕷遺傳多樣性分析尚未見報道。因此，本研究采用ISSR分子標記法分析野生和栽培廣山藥遺傳多樣性，研究結果將為廣山藥親緣關系和品種選育提供科學依據。

表1 用于ISSR分析的褐苞薯蕷的樣品

1 實驗材料

1.1 實驗樣品的采集

本實驗采集褐苞薯蕷地上部分，分別來自廣西南寧、桂林、貴港、柳州、欽州、玉林、百色、梧州、賀州、防城港、河池、來賓、湖南永州、廣東韶關，摘取其新鮮葉片作為供試材料，立刻裝入含硅膠的密封袋中，并勤換硅膠，直至樣品干燥完全。所采集的樣品經廣西中醫藥大學藥用植物教研室梁子寧教授鑒定為：薯蕷科薯蕷屬褐苞薯蕷。樣品保存于廣西中醫藥大學壯瑤藥協同創新中心樣品儲存室-20℃冰箱，備用。樣品采集信息見表1。

1.2 ISSR引物合成與處理

本實驗所用150 條引物，其中100 條來自哥倫比亞大學（UBC）公布的通用引物，其余50 條為自設引物，自設引物遵循ISSR 引物設計原則：2-3 個堿基簡單重復4-5 次，一端或者兩端加2-4 個錨定堿基。引物均由華大基因公司合成。引物合成后，按要求對引物進行處理：將引物管離心數秒，使DNA 聚集到管底，小心開啟管蓋，以免引起粉末飛揚丟失。按說明書加入適量ddH2O或TE緩沖液將其稀釋成10 μM 的濃度，分裝置-20℃保存備用。

2 實驗儀器與試劑

2.1 實驗儀器

自動高壓滅菌鍋（Panasonic MLS-3781L），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒DHG-9240A），手掌型離心機（大龍D1008），高速冷凍離心機（德國賽默飛），梯度PCR 儀（Bio-Rad T100），電泳儀（Bio-Rad），凝膠成像儀（Bio-Rad），超純水一體機（Merck Millipore Direct-Q 5UV），渦旋振蕩儀（上海滬西XW-80A），水浴鍋(上海天恒HWS-24)

2.2 實驗試劑

DNA 提取試劑盒、RNase 酶、D2000 DNA Marker（天根生化科技有限公司），GelRed 染料（美國Biotium公司），瓊脂糖（美國英杰生命技術有限公司）

3 實驗方法

3.1 葉片基因組DNA提取

對所有樣品進行總DNA 的提取，方法按照植物總DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）操作步驟，將提取的總DNA分裝至-20℃保存備用。

3.2 引物的篩選

用104份褐苞薯蕷樣品對150條ISSR 引物進行擴增篩選，所有的PCR 產物經1.2%瓊脂糖凝膠（含GelRed 核酸染料）檢測，篩選出條帶多、清晰、多態性好的引物用于本次實驗。

3.3 PCR擴增

ISSR-PCR 反應體系設置為：PCR 反應體系的體積為20 μL，2 × Taq PCR Mastermix 10 μL，引物1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 8 μL。ISSR-PCR 擴增程序為：95℃預變性5 min，95℃變性40 s，退火45 s（不同引物Tm值決定），72℃延伸2 min，34個循環，72℃延伸5 min，4℃保存[7]。

3.4 電泳檢測

取7 μL PCR 產物置于1.2%的瓊脂糖凝膠（含GelRed 染料）中進行電泳，電壓60 V，電泳80 min，用D2000 DNA Marker 作為標準參照。電泳結束后，在紫外凝膠成像儀中觀察并拍照保存。

3.5 數據統計和分析

3.5.1 擴增條帶的統計與矩陣圖的建立

ISSR 為顯性標記，同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為是同一位點的產物[8]。對凝膠電泳圖進行分析，同一位點有相同的擴增條帶記為“1”，無則記為“0”，從而得到“1”和“0”的矩陣圖[9]。

表2 ISSR擴增中使用的引物

3.5.2 分析軟件對數據的處理

采用 POPGENE1.32、NTSYS2.10 軟件對 SSR-PCR數據進行歸類和分析。利用POPGENE1.32計算出：等位基因數（Number of alleles，Na）、有效等位基因（Number of effective alleles，Ne）、Shannon's 信息指數（I）、Nei's 基因多樣性指數（h）等遺傳多樣性參數，居群內基因多樣性（Hs）、居群總基因多樣度（Ht）、居群間遺傳分化系數（Gst）以及基因流（Nm）等遺傳分化指標，然后利用NTSYS2.10軟件做聚類分析圖。

4 結果

4.1 引物的篩選

本實驗從150 條引物中篩選出9 條重復性好、條帶清晰且多態性高的引物，其中包含通用引物7條，自設引物2 條（自設引物序列在此因保密要求不做公開），可用于遺傳多樣性分析。引物序列見表2。

表3 褐苞薯蕷居群ISSR選擇性擴增引物產生的多態性條帶

4.2 遺傳多樣性分析

4.2.1 引物擴增結果

采用篩選出的9 條引物的最佳退火溫度對104 份褐苞薯蕷總DNA 進行擴增，共擴增出條帶106 條（圖1、表3），其中多態性條帶104 條，多態性百分比（PPB）為98.11%。其中引物多態性百分比最高達100%，引物多態性百分比最低為88.89%。

4.2.2 不同居群的樣品遺傳多樣性分析

本實驗采用POPGENE1.32 軟件對不同居群的褐苞薯蕷樣品進行遺傳多樣性分析（表4），居群名稱后“1”代表栽培樣品居群，“2”代表野生樣品居群。通過等位基因數（Na）、有效等位基因（Ne）、Nei's 基因多樣性指數（H）和Shannon's 信息指數（I）這幾個參數來反映供試樣品的遺傳多樣性。由整體樣本的物種水平可知，褐苞薯蕷的 Na 值為 1.9811，Ne 值為 1.6357，H 值為0.3675，I 值為0.5439，說明供試褐苞薯蕷樣品整體遺傳多樣性水平較高；野生樣品居群的Na值、Ne值、H值、I 值平均為 1.5006、1.3847、0.2108、0.3039，栽培樣品 居 群 的 Na 值 、Ne 值 、H 值 、I 值 平 均 為 1.4163、1.3080、0.1698、0.2469，兩者比較來看，供試褐苞薯蕷野生居群樣品比栽培居群樣品具有更高的遺傳多樣性。

表4 褐苞薯蕷居群間的遺傳多樣性指數

圖1 引物UBC823的PCR擴增電泳圖（圖中樣品編號分別對應表1中各樣品）

表5 褐苞薯蕷居群間遺傳分化系數及基因流

4.2.3 遺傳分化的分析

本實驗采用POPGENE1.32 軟件對不同居群苞薯蕷樣品進行遺傳分化分析，結果見表5，來自不同居群褐苞薯蕷居群總基因多樣度（Ht）為0.3527，居群內基因多樣性（Hs）為0.1892，居群間遺傳分化系數（Gst）為0.4636。其中Gst＞Hs，說明褐苞薯蕷居群間遺傳分化度比居群內遺傳分化度更高。基因流（Nm）為0.5785 ＜1，說明褐苞薯蕷居群間遺傳分化水平較低，不同居群間基因交流較少。

4.2.4 遺傳距離的分析

采用POPGENE1.32 軟件對不同居群褐苞薯蕷的遺傳距離進行分析，褐苞薯蕷的Nei's 遺傳相似度和Nei's遺傳距離見表6。不同居群的褐苞薯蕷遺傳相似度在0.7105-0.9107 范圍內，遺傳距離在0.0936-0.3418范圍內，說明不同居群的遺傳相似度較高，遺傳距離較近；其中，湖南永州和廣東韶關樣品的遺傳相似度為0.9107，遺傳相似度最高；欽州和賀州樣品的遺傳相似度為0.7105，遺傳相似度最低。湖南永州和廣東韶關的遺傳距離為0.0936，遺傳距離最小；欽州和賀州樣品的遺傳距離為0.3418，遺傳距離最大。

4.2.5 不同居群樣品的NTSYS聚類分析

采用NTSYS2.10軟件對不同居群褐苞薯蕷進行聚類分析，聚類圖見圖2。遺傳相似度在0.78，可將褐苞薯蕷分成兩大類，第1類包括12個居群的樣品，第2類包括4個居群的樣品。

遺傳相似度在0.82 時，可將第1 類分為3 個亞類，第1 亞類為南寧居群的栽培和野生樣品；第2 亞類為桂林、柳州、百色、河池、賀州居群的野生樣品；第3 亞類為桂林、貴港、梧州、賀州的栽培居群樣品。遺傳相似度在 0.82 時，可將第 2 類分為 2 個亞類，第 1 亞類為欽州和玉林居群的栽培樣品；第2 亞類為湖南永州居群的栽培樣品和廣東韶關居群的野生樣品。

由上可知，大部分的野生樣品居群聚在一起，大部分的栽培樣品也是聚在一起的，表明供試褐苞薯蕷的野生樣品和栽培樣品是存在差異的；南寧居群的野生和栽培樣品聚為一類，表明南寧居群的栽培樣品為就近移栽；相近居群的野生樣品和栽培樣品分別聚在一起，表明大部分樣品的遺傳距離與地理位置有關。

表6 不同褐苞薯蕷居群遺傳相似度（左上角）與遺傳距離（右上角）

圖2 不同褐苞薯蕷居群聚類圖，居群名稱參見表1

5 討論

褐苞薯蕷作為一種很有發展前景的藥食兩用的植物，已受到人們廣泛關注，民間有崇尚食用野生廣山藥進補的傳統，市場上大宗商品多為栽培品[10]。已有一些研究表明，褐苞薯蕷褐可以作為山藥長期藥用及食用且具有一定的科學根據[11，12]。如今，ISSR 分子標記技術已廣泛被應用于野生與栽培品種鑒定，蔣雨晗等[13]在對白芍親緣關系進行研究，ISSR 分子標記技術能有效檢測栽培白芍遺傳多樣性，揭示白芍遺傳背景以及栽培白芍遺傳距離的大小和親緣關系的遠近。孫稚穎等[14]采用ISSR 標記對金銀花種質資源遺傳多樣性進行分析，研究顯示ISSR標記可以很好為金銀花的種質資源鑒定、遺傳關系分析及栽培育種提供分子生物學依據。有學者[15-19]采用ISSR技術對中藥的野生品與栽培品進行了比較，研究結果均顯示該分子標記在遺傳多樣性方面能區分野生品和栽培品。

本研究采用ISSR 技術對不同居群褐苞薯蕷進行遺傳分析，篩選出9 條擴增效果較好的引物用于此次實驗，擴增多態性條帶104 條，多態性百分比（PPB）為98.11%，有效等位基因（Ne）為1.6305，Nei's 基因多樣性指數（H）為 0.3653 和 Shannon's 信息指數（I）為0.5413，以上結果均表明ISSR 分子標記方法適用于褐苞薯蕷的遺傳多樣性分析，本次實驗所采樣本在褐苞薯蕷DNA 水平上具有較高的遺傳多樣性水平；野生樣品居群的 Na 值、Ne 值、H 值、I 值均高于栽培樣品居群，表明褐苞薯蕷野生居群樣品比栽培居群樣品具有更高的遺傳多樣性；聚類結果表明褐苞薯蕷遺傳距離與地理距離具有一定的相關性，樣品所在地理位置和氣候特點愈相似，樣品間的生物遺傳信息愈相近；同時野生品和栽培品之間存在遺傳差異。

本研究利用ISSR 分子標記技術從基因組水平揭示了不同居群褐苞薯蕷種質資源的遺傳差異及親緣關系，進而分析其遺傳多樣性，有助于褐苞薯蕷種質資源的利用、發展與保護。