固本增骨方對去卵巢大鼠血清BGP、TRACP-5b及骨質(zhì)量的影響＊

宋 敏，鞏彥龍，董萬濤，黃 凱，董 平，3，侯紅艷，宋志靖，文浩楠

（1. 甘肅中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院，蘭州 730000；2. 甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，蘭州 730020；3. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院，呼和浩特，010010）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）的發(fā)生發(fā)展涉及到機體多系統(tǒng)、多組織、多器官功能的異常，統(tǒng)計顯示，骨質(zhì)疏松癥影響了近54%老年患者的生活質(zhì)量[1]，女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（postmenopausal osteoporosis，PMOP）的發(fā)病率是男性的三倍，這主要是由絕經(jīng)后雌激素缺乏引起的[2]。OP 與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（neuroendocrine-immune，NEI）網(wǎng)絡密切相關(guān)，可從脾腎進行論治[3]。骨密度（bone mineral density，BMD）監(jiān)測可以診斷和預防骨質(zhì)疏松，尤其對絕經(jīng)后婦女顯得更為重要[4]。通過監(jiān)測BMD，不僅可以預測OP 性骨折的發(fā)病風險，還可以根據(jù)患者具體情況，積極采取相應的預防和治療措施，以減少OP 及骨折的發(fā)生。固本增骨方為臨床經(jīng)驗方，前期實驗研究證實[5，6]，其可從激素、礦物質(zhì)代謝等方面改善骨質(zhì)量，以達到防治OP 的目的。本研究采用切卵巢法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，給予固本增骨方進行干預，旨在觀察去勢大鼠骨密度、骨代謝、骨生物力學性能及骨組織中游離[Ca2+]i 濃度的變化情況，為固本增骨方治療PMOP提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

購自甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心的雌性SD 大鼠60只，180±20 g，SPF級實驗室條件下飼養(yǎng)。

1.2 藥物

固本增骨方由甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房提供。戊酸雌二醇片（補佳樂，規(guī)格1mg*21 片，國藥準字J20030089，批號：208A）；水合氯醛250g/瓶（上海邦景實業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號：302-17-0）。

1.3 試劑

大鼠血清BGP ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號E-EL-R0243c）、TRAP-5b ELISA 試劑盒（廣州徠智生物科技有限公司，貨號BSE12945R1）、Calcium Crimson（TM）、AM 熒光探針（Invitrogen公司，貨號C3018）。

1.4 儀器

雙能X 線骨密度儀（美國Hologic 公司，型號Discovery Wi），AG-X 系列臺式電子萬能試驗機（島津公司，日本），激光共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，型號FV3000），震蕩切片機（德國徠卡公司，型號VT1000），（日本型號，型號HADAIA3601）。

1.5 方法

1.5.1 大鼠造模及分組

60 只大鼠適應性喂養(yǎng)10 天后，隨機分為6 組：空白對照組、模型組、戊酸雌二醇組、固本增骨方高、中、低劑量組，各10 只。除空白對照組外，其余大鼠均采用去卵巢法[6]復制骨質(zhì)疏松模型，以上實驗操作均在甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗室中進行。

1.5.2 大鼠行為學改變

觀察動物生理情況如精神狀態(tài)、毛色、攝食、飲水、行為、糞便、分泌物等，并記錄體質(zhì)量。

1.5.3 干預方法

采用雙能X 線骨密度測量儀于造模后3月檢測各組大鼠骨密度，以確定骨質(zhì)疏松模型成功。各組大鼠給予對應藥物干預，空白組和模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，固本增骨方低、中、高劑量組以成人常規(guī)劑量按人-動物的體表面積計算法折算成等效劑量（分別為0.1 g·kg-1、0.2 g·kg-1、0.4 g·kg-1，并按照1 ml/每100 g體質(zhì)量蒸餾水稀釋，制成固本增骨方含藥混懸液灌胃，戊酸雌二醇組按人鼠等效劑量給予，每日90 ug·kg-1。

1.5.4 血清骨代謝指標檢測

所有動物用藥干預12 周后，禁食水，腹腔注射麻醉，心臟取血 3 mL，3000 r·min-1離心 10 min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩８髦笜藝栏癜凑赵噭┖姓f明書運用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）檢測大鼠血清骨生成代謝指標骨鈣素（osteocalcin，BGP）及骨吸收代謝指標抗酒石酸磷酸酶（tartrate-resistant phosphatase，TRACP-5b），在 450 nm波長下測光密度（OD 值），計算血清BGP、TRAP-5b含量。

1.5.5 大鼠全身骨密度檢測

上述各組大鼠在藥物干預12 周后，禁食12 h，10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，采用雙能X 線骨密度測量儀（包含有大鼠梯級標準模型和分析軟件）檢測，獲得大鼠全身骨密度。

1.5.6 三點彎曲試驗

解剖分離左側(cè)股骨標本，剔除標本周圍肌肉、韌帶等軟組織，進行三點彎曲試驗。將大鼠左側(cè)股骨置于AG-X 系列臺式電子萬能試驗機，兩支點跨距為17 mm，設置加壓點為股骨中點，以2 mm·min-1加載速度開始檢測后，用計算機記錄載荷-位移曲線，采用C語言編程處理載荷變形曲線得出最大載荷、彈性模量等骨生物力學指標值。

1.5.7 股骨組織中游離[Ca2+]i濃度測定

各組大鼠麻醉處死后立即取股骨組織，用振蕩切片機切成厚度約200-300 um 的薄片，染色后，觀察染色的組織細胞的某一層面的熒光圖像。Laser sharp 2000軟件掃描并拍攝圖片。

1.6 統(tǒng)計學分析

本實驗研究所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，設定檢驗水準α=0.05，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學改變

造模前，各組動物精神狀態(tài)良好，被毛光潔聳立，反應靈敏，攝食、飲水、尿量正常，大便成形。造模術(shù)后24 h，大鼠恢復正常飲食、飲水，生存狀態(tài)良好。術(shù)后切口恢復良好。用藥干預12周，空白對照組動物體質(zhì)量逐漸增加，飲水、攝食、尿量均正常，且毛色光亮，行動敏捷。模型對照組動物精神狀態(tài)較差，逐漸出現(xiàn)毛色不光、食量減少、行為遲緩、喜聚堆、弓背蜷縮、稀便等，體質(zhì)量增加不明顯；各藥物干預組狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠骨密度比較

造模后3 月，各組大鼠BMD 檢測發(fā)現(xiàn)：除空白對照組外，其余各組大鼠BMD 顯著性降低（P＜ 0.05），證明OP 模型成功。給予藥物干預后，與模型對照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組BMD 值明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且固本增骨方高濃度組明顯高于低濃度組（P＜0.05），呈量效依賴關(guān)系，固本增骨方各組與戊酸雌二醇組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）（表1）。

2.3 各組大鼠血清骨生成及骨吸收代謝指標比較

與空白對照組比較，模型對照組大鼠BGP、TRAP-5b 含量明顯升高（P＜ 0.05）；給予藥物干預后，與模型對照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組BGP、TRAP-5b 含量均明顯下降（P＜ 0.05）；固本增骨方高濃度組優(yōu)于固本增骨方低濃度組（P＜0.05）（表2）。

2.4 大鼠股骨生物力學測試

大鼠股骨三點彎曲試驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組大鼠股骨最大載荷、彈性模量明顯降低（P＜0.05）。給予藥物干預后，與模型對照組對比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組股骨最大載荷、彈性模量升高，且固本增骨方高濃度組與低濃度組差異有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），呈量效依賴關(guān)系，固本增骨方各組與戊酸雌二醇組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）（表3）。

表1 各組大鼠全身骨密度測量值比較（，n=10）

表1 各組大鼠全身骨密度測量值比較（，n=10）

注：造模后3 月，與空白對照組比較*P ＜0.05；干預12w 后，與模型對照組比較**P ＜0.05，與固本增骨方低劑量組比較△P ＜0.05，與戊酸雌二醇組比較▲P ＞ 0.05。

組別空白對照組模型對照組戊酸雌二醇組固本增骨方低濃度組固本增骨方中濃度組固本增骨方高濃度組干預后0.182±0.014 0.146±0.001 0.178±0.011**0.172±0.006**▲0.185±0.008▲0.189 ± 0.011**△▲BMD（g·cm-2）干預前0.185±0.007 0.143±0.007*0.141±0.002*0.139±0.006*0.145±0.001*0.146±0.010*

表2 各組大鼠全身骨密度測量值比較（，ng/mL，n=10）

表2 各組大鼠全身骨密度測量值比較（，ng/mL，n=10）

注：與空白對照組比較*P ＜0.05；與模型對照組比較▲P ＜0.05，與固本增骨方低濃度組比較△P ＜0.05。

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表3 各組大鼠股骨三點彎曲（左）試驗的結(jié)果（，n=10）

表3 各組大鼠股骨三點彎曲（左）試驗的結(jié)果（，n=10）

注：與空白對照組比較■P ＜0.05，與模型對照組比較*P ＜0.05，與固本增骨方低濃度組比較△P ＜0.05，與戊酸雌二醇組比較▲P ＞0.05。

彈性模量（mPa）197.05±26.68 147.78±16.88■192.54±15.65*169.58±15.40*▲177.16±12.16▲198.39 ± 9.42*△▲組別空白對照組模型對照組戊酸雌二醇組固本增骨低濃度組固本增骨中濃度組固本增骨高濃度組最大載荷（N）35.88±7.90 15.90±2.39■36.83±9.91*25.18±3.20*▲26.50±7.44▲33.03 ± 7.56*△▲

2.5 大鼠股骨游離[Ca2+]i濃度比較

圖1 各組大鼠股骨游離[Ca2+]i濃度（×100 um）

表4 各組大鼠股骨組織[Ca2+]i（熒光值）比較（，n=10）

表4 各組大鼠股骨組織[Ca2+]i（熒光值）比較（，n=10）

注：與空白對照組比較■P ＜0.05，與模型對照組比較*P ＜0.05，與固本增骨方低濃度組比較△P ＜0.05，與戊酸雌二醇組比較▲P ＞0.05。

熒光值45.32±1.93 29.41±3.07■39.27±2.58*35.29±1.76*▲35.81±2.18▲37.74 ± 2.26*△▲組別空白對照組模型對照組戊酸雌二醇組固本增骨低濃度組固本增骨中濃度組固本增骨高濃度組

與空白對照組比較，模型對照組大鼠股骨游離[Ca2+]i 濃度明顯降低（P＜ 0.05）；藥物干預后，與模型對照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組股骨游離[Ca2+]i 濃度均明顯升高（P＜0.05）；且固本增骨方高濃度組優(yōu)于固本增骨方低濃度組（P＜0.05）（圖1、表1）。

3 討論

我國是世界人口大國，人口基數(shù)大，隨著我國人口老齡化進程的加快，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也在逐步增加，骨質(zhì)疏松及其導致的骨折等嚴重并發(fā)癥，不僅給患者造成了沉重的經(jīng)濟負擔，而且占據(jù)了大量的醫(yī)療資源。PMOP 尤其令人關(guān)注，因它導致骨折的風險增加，對老年婦女的健康產(chǎn)生負面影響[7]。雌激素可通過降低核因子-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor kabba beta ligand，RANK）的活性和增加成骨細胞中的BGP 表達而降低破骨細胞分化，以調(diào)節(jié)骨質(zhì)量和骨微結(jié)構(gòu)；而絕經(jīng)和卵巢切除術(shù)后，骨轉(zhuǎn)化率增加50%-100%，由于雌激素短期內(nèi)急劇減少可以通過上調(diào)核因子-κB受體活化因子RANK 的表達和增加促炎細胞因子的活性，以激活骨細胞的骨破壞作用[8]。

PMOP 屬于祖國醫(yī)學“骨痿”“骨枯”等范疇。《景岳全書·痿論》曰：“腎者，水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”，可見骨痿由腎藏于骨之髓不充滿所致，即所謂“骨枯髓空”；《靈樞·決氣篇》曰“谷氣入滿，淖澤注于骨”，言明了飲食化生水谷精微影響骨的生長，骨與脾胃關(guān)系密切；《素問·五臟生成篇》曰：“腎之合骨也，其榮在發(fā)，其主脾也”，即若脾虛不運，則肌肉痿弱，水谷精微不能生精化髓，骨髓濡養(yǎng)無源，引發(fā)“骨痿”，可見先天腎與后天脾共司骨骼與肌肉作為人體運動的基礎[9]。本研究治PMOP 從中醫(yī)辨證理論及中藥藥理出發(fā)，以“骨枯髓空、骨肉不相親”為病機關(guān)鍵，從脾、腎論治，治以益氣健脾、補腎壯骨，確立“固本增骨丸”方。

骨密度是臨床骨質(zhì)疏松診斷、危險性、預后及療效評估的金指標，但是單純的全身或局部骨密度測定無法全面的了解患者的骨代謝、各組織器官水平與骨形成/破壞相關(guān)的信息，在一定程度上無法完全反映骨生物力學、生物信息的完整性[10]。通過對骨生物力學的研究，不僅能反應骨組織在外力作用下的力學特性，而且能反映出骨組織在受力后所產(chǎn)生的生物學效應，單位體積內(nèi)骨量減少、骨質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)（包括骨小梁結(jié)構(gòu)、密度等）的改變均能影響骨生物力學，從而降低骨生物力學強度。生物力學性能包括骨組織的結(jié)構(gòu)力學和材料力學，常見指標包括最大載荷、彈性模量等，骨生物力學是評價藥物對骨質(zhì)量的一項可靠指標[11]。骨骼鈣狀況對OP 風險的評估非常重要[12]，直接測量的電離鈣（M-ICA）被認為是OP 評估的金標準[13]，骨骼中游離的鈣離子在鈣調(diào)蛋白、蛋白激酶、腺苷酸環(huán)化酶和環(huán)磷酸腺苷磷酸二酯酶等多種信號轉(zhuǎn)導分子的作用下，沉積在骨骼，有利于骨健康[14]。

本研究各組大鼠全身BMD測量結(jié)果顯示：與空白對照組相比，模型對照組大鼠BMD 值顯著降低（P＜0.05），說明在大鼠卵巢切除3 月后，全身BMD 下降，OP 模型復制成功；給予藥物干預后，與模型對照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方組均可不同程度地提高BMD 值，且固本增骨方呈量效依賴關(guān)系，說明固本增骨方可以明顯改善卵巢切除大鼠骨密度。研究顯示：成骨細胞（osteoblast，OB）分泌BGP[15]，血清BGP 的變化能反映OB 的活性，TRACP-5b[16]可反映破骨細胞（osteoclast，OC）數(shù)量及功能活性。本研究結(jié)果顯示，模型對照組大鼠血清BGP、TRACP-5b 含量均增高（P＜ 0.05），說明大鼠卵巢切除后，OC 和OB 活性均增強，骨轉(zhuǎn)換速率加快導致骨量流失增加，呈“高轉(zhuǎn)換型”。而經(jīng)過用藥干預后，與模型對照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組血清BGP、TRACP-5b 含量均明顯降低（P＜0.05），說明戊酸雌二醇組和固本增骨方均可影響OC 和OB 活性而改善骨代謝。大鼠股骨三點彎曲試驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組大鼠股骨最大載荷、彈性模量明顯降低（P＜0.05），而經(jīng)過固本增骨方治療12 周后，能明顯改善卵巢切除大鼠股骨結(jié)構(gòu)生物力學性能，最大載荷、彈性模量均有所升高（P＜0.05），說明大鼠卵巢切除后，隨著體內(nèi)雌激素水平的降低，骨量丟失，骨脆性增大，固本增骨方在一定程度上可以改善卵巢切除大鼠股骨結(jié)構(gòu)的生物力學性能性，增加骨強度，提高骨剛度及抗骨變性和骨折能力；大鼠股骨游離[Ca2+]i 濃度比較顯示，與空白對照組比較，模型對照組大鼠股骨游離[Ca2+]i 濃度明顯降低（P＜ 0.05），藥物干預后，與模型對照組相比，戊酸雌二醇組和固本增骨方各組股骨游離[Ca2+]i 濃度均明顯升高（P＜0.05）；且固本增骨方高濃度組優(yōu)于固本增骨方低濃度組（P＜0.05），說明去卵巢OP 大鼠，骨組織中鈣離子濃度降低，固本增骨方在一定程度上能提高骨組織中鈣離子濃度，從而發(fā)揮抗OP 的作用；而戊酸雌二醇組和固本增骨方不同劑量組結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義，說明固本增骨方在改善骨生物力學性能及提高骨組織中鈣離子濃度方面，具有雌激素樣作用。

固本增骨方是甘肅中醫(yī)藥大學宋敏教授應用于臨床多年總結(jié)的經(jīng)驗方，由炙黃芪、白條黨參、岷當歸、炙淫羊藿、燙狗脊、鹽補骨脂組成，方中大量應用君藥炙黃芪以補氣升陽，生津養(yǎng)血；臣藥黨參補中益氣、生津和胃，二藥相配健脾補氣[17]，當歸補血活血，二者共為臣藥，輔助黃芪，在益氣養(yǎng)血的同時，提高脾之運化功能，增加后天氣血生化之源，健脾，后天脾氣資助先天腎氣。補骨脂、淫羊藿溫腎陽、強筋骨，燙狗脊補益肝腎、填精益髓，三藥合用，則可溫腎陽、填精髓、壯腰膝，共為佐藥[18，19]。諸藥合用，共奏脾腎雙補、溫陽益氣、活血通絡之功效，標本兼顧，有效緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者脾腎兩虛型骨質(zhì)疏松癥狀。本實驗研究結(jié)果顯示：固本增骨方可改善卵巢切除大鼠模型全身骨密度，改善骨代謝，有效提升骨生物力學性能，提高股骨組織游離[Ca2+]i 濃度，從而發(fā)揮對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治作用。