扶正消瘤顆粒對原發性肝癌血清中VEGF、HIF-1α表達的影響及臨床意義＊

陳曉琦，張鵬鴿，陳新蕊，冀愛英，呂 轉，趙云霞，陳欣菊，邵明義＊＊

（1. 河南中醫藥大學第一附屬醫院消化科 鄭州 450000；2. 河南中醫藥大學第一臨床醫學院鄭州 450000；3. 河南中醫藥大學第一附屬醫院行政科 鄭州 450000）

原發性肝癌（Primary hepatocellular carcinoma，PHC，簡稱肝癌）是指原發在肝細胞或肝內膽管上皮細胞的惡性腫瘤，其中肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的類型。肝癌因其生長快、易復發、生存期短等特性一直位居我國腫瘤致死原因的前3 位，所以對于肝癌的治療應不斷探索并創新，以求取得突破性進展。TACE 是目前肝癌最常用的非手術方式之一，適于肝功能較好、瘤體血供豐富或因其他原因不愿接受手術切除術的患者。研究表明，經導管動脈化療栓塞術（Transcatheter arterial chemoembolization，TACE）在延緩腫瘤進展、延長生存時間方面有顯著作用。這種治療手段與肝癌的新生血管生成密切相關，我們以此來探討肝癌的微血管生成機制和藥物的臨床療效。

血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和缺氧誘導因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是人體內微血管生成的核心因子，正常成人體內含量較低，但當人體由于實體瘤或其他原因造成局部缺氧微環境時，兩者表達水平升高，這是因為HIF-1α 在低氧條件下仍具有轉錄活性，而且能調控VEGF的基因轉錄與表達。以往大量的動物實驗和臨床研究表明，實體腫瘤早期，瘤內細胞的缺氧環境可導致HIF-1α 在腫瘤組織和外周血中的表達呈上升趨勢，VEGF 作為HIF-1α 的下游靶蛋白也隨之表達增加，VEGF 能促進瘤體的微血管生成、改善瘤體邊緣的細胞能量代謝，從而促進腫瘤的發展、侵襲和轉移。

本研究團隊自2010 年開始采用TACE、射頻消融術（Radio Frequency Ablation，RFA）、碘粒子植入等多種微創技術聯合治療肝癌的同時，更著重于觀察中醫藥對肝癌患者的影響。本團隊認為正氣和邪氣不斷斗爭導致邪盛正虛，引起了肝癌的發生，其中的邪氣包括氣滯、血瘀、濕熱、痰濁等，且各種邪氣之間彼此影響、互相加重，所以臨床中患者證型并不單一存在，而研究發現［1］，化療栓塞治療后中醫證型多集中于脾虛濕盛、血瘀、濕熱。在此理論基礎上，以“扶正祛邪”為總的治療原則，針對微創術后最常見的中醫證型創制扶正消瘤方，功可疏肝健脾，清熱化痰，軟堅散結，祛瘀止痛，適用于本研究中的所有患者。本研究團隊經多年的臨床觀察及研究［2-4］發現扶正消瘤方在誘導細胞凋亡、改善臨床癥狀、提高生活質量、控制病情發展等方面有其獨特優勢。雖然中醫藥對肝癌癥狀的改善方面有明顯優勢，但中醫藥與血管生成分子水平的關系研究仍比較缺乏。

基于前人對血管生成的研究成果，本研究通過測定原發性肝癌患者在不同因素干預情況下、不同時間點的血清中VEGF、HIF-1α 水平、治療前后生活質量評分的變化情況以及血清中VEGF、HIF-1α 水平與生活質量的相關性，進一步明確肝癌血管生成的機制，探討中醫藥對肝癌抗血管生成、改善患者生活質量等方面的作用，為中醫藥治療肝癌提供新思路與理論依據。

1 病例來源與標準

1.1 病例來源

河南中醫藥大學第一附屬醫院消化科2018 年1月至2018 年12 月入院，確診為原發性肝細胞癌（HCC，以下簡稱肝癌）的患者66例。采用隨機對照研究方法，將66 例研究對象分為對照組和試驗組，每組33例。

1.2 病例選擇標準

①符合原發性肝癌診斷標準；②肝功能Child-Pugh 分級 A 級或 B 級，肝癌分期為Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa期；③年齡在18 歲-75 歲（含18，75 歲）之間，性別不限；④預計生存期在6個月以上；⑤符合TACE、RFA等治療適應癥；⑥自愿參加本研究，依從性好，簽署知情同意書。

1.3 排除標準

①有嚴重黃疸、腹水、全身廣泛轉移等微創治療絕對禁忌癥者；②較大腫瘤突出于肝臟表面，靠近膽囊、肝門部及胃腸道的腫瘤；③合并心、腦、肺、腎、造血系統等嚴重原發性疾病；④妊娠期或哺乳期婦女；⑤嘔吐頻繁或厭服中藥者；⑥過敏體質，對多種藥物有過敏史者；⑦近1 月內接受過手術、微創等治療，或服用其他中藥抗癌制劑或免疫調節劑的患者；⑧3 個月內參加過或正在參加其他臨床試驗者。

1.4 剔除、脫落標準

①受試者依從性差，未能規律配合用藥，或中途停止治療而無法判斷療效者；②患者治療過程中病情惡化，不能繼續治療或死亡者；③發生嚴重的不良事件，不宜繼續臨床試驗者；④觀察過程中自然脫落、失訪者；⑤臨床資料或實驗室數據不全，導致無法判定療效者；⑥受試過程中或隨訪觀察期間，服用了影響試驗結果的藥物；⑦患者治療過程中要求中止進行本臨床試驗研究或改用其他治療方法的。

2 方法

2.1 治療分組

對照組：TACE 序貫RFA + 西醫基礎治療（抗病毒、保肝降酶、對癥支持等）；

試驗組：扶正消瘤顆粒（組成：黃芪30 g、菝葜30 g、黨參15 g、白術15 g、白芍15 g、丹參30 g、鱉甲20 g、牡蠣30 g、人參30 g、陳皮12 g、柴胡10 g、甘草6 g（江陰天江藥業有限公司制備顆粒劑）；用法：沖服，每日1劑，早晚溫服，每次200 mL）+TACE 序貫RFA + 西醫基礎治療；

治療過程：3 個月為1 個療程。分別于TACE 前1天、TACE 后 1 天、TACE 后 1 周（即 RFA 后）、TACE 后 1月、TACE 后3 月（下文中各時間點可簡稱為術前1 天、術后 1 天、術后 1 周、術后 1 月、術后 3 月。）采集患者外周血3-5 mL，常溫下靜置1 h，然后置于離心機，以3000 r·min-1的轉速離心10 min，取上層血清置于-80℃冰箱中保存待檢。避免反復凍融。抽取血樣標本過程均取得患者的知情同意。

2.2 試劑盒

測定血清VEGF 和HIF-1α 的試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司。

2.3 測定過程（VEGF和HIF-1α相同）

取出待測血清室溫下解凍；在酶標板上設置8 個標準孔，每孔中按使用說明配制可用濃度的標準品50 μL；設置樣本孔和空白對照孔；密封后置入37℃恒溫箱溫育30 min；然后洗滌、加酶、顯色，終止后用酶標儀450 nm 波長測定吸光度（即OD 值），再計算樣本相應濃度。

3 統計學方法

采用SPSS23.0 軟件對本研究數據進行統計學分析，計量資料用均數± 標準差表示。比較VEGF 和HIF-1α 不同時期濃度變化、VEGF 和 HIF-1α 表達與臨床分期的相關性用單因素方差分析，比較兩因子表達趨勢與中藥干預的相關性用重復測量數據的方差分析，VEGF 和HIF-1α 表達水平的相關性用Pearson相關性分析。基線資料中計量資料用單因素方差分析，計數資料用卡方檢驗或Fisher 確切概率法。P＜0.05認為差異有統計學意義。

4 結果

4.1 基線資料比較

納入對象一共66 例，其中男性54 例，女性12 例；年齡最大 74 歲，最小37 歲，平均年齡 57.35 ± 9.98 歲；在合并乙型肝炎、Child-Pugh 分級、AFP 值、臨床分期方面試驗組和對照組差異無統計學意義（P＞0.05），兩組有可比性（表1）。

4.2 VEGF和HIF-1α的相關性

本研究把所有納入對象（不論術前還是術后各個時間點）的血清VEGF、HIF-1α 水平進行Pearson 相關性分析發現，VEGF 和HIF-1α 水平呈線性正相關（r=0.829，P＜ 0.001）（圖1）。

表1 基線資料情況比較

圖1 本研究中VEGF和HIF-1α的相關性

4.3 不同時期VEGF、HIF-1α水平變化

分析各個時間點 VEGF、HIF-1α 水平變化時，考慮到對照組未使用扶正消瘤顆粒，微創治療中的影響因素只有時間點不同，所以分析對照組可以明確TACE 序貫 RFA 治療對 VEGF、HIF-1α 水平的影響。對照組患者血清中VEGF 水平隨時間遞推，TACE 后1天較術前1 天明顯升高，后逐漸下降（P＜ 0.05），TACE后1、3 月間無明顯差異，均降至術前水平（P＞ 0.05）。HIF-1α 水平隨時間遞推，TACE 后1天明顯升高，后逐漸下降（P＜ 0.05），但TACE 后3 月仍高于術前（P＜0.05）（表2）。

4.4 扶正消瘤顆粒對VEGF、HIF-1α的影響

試驗組不同時期VEGF、HIF-1α 兩因子水平變化：VEGF 水平隨時間遞推，TACE 后1天較術前1天明顯升高，后逐漸下降（P＜ 0.05），TACE后1月、3月間無明顯差異，均降至術前水平（P＞ 0.05）。HIF-1α 水平隨時間遞推，TACE 后1 天較術前1 天明顯升高，后逐漸下降（P＜ 0.05），TACE 后3 月降至術前水平（P＞0.05）（表3）。

表2 本研究中對照組不同時期VEGF、HIF-1α濃度變化

表3 本研究中試驗組不同時期VEGF、HIF-1α濃度變化

表4 本研究中試驗組和對照組不同時期VEGF、HIF-1α濃度變化比較

試驗組與對照組之間比較，用重復測量資料方差分析。①VEGF：試驗組與對照組相比，術前1 天、TACE 后1 天兩組間無明顯差異（P＞ 0.05），TACE 后1周、1月、3月兩組間差異有統計學意義（P＜ 0.05）。②HIF-1α：試驗組與對照組相比，術前1天、TACE后1天兩組間無明顯差異（P＞ 0.05），TACE 后1 周、1 月、3 月兩組間差異有統計學意義（P＜ 0.05）（表4）。

4.5 扶正消瘤顆粒對生活質量評分的影響

參照2001 年由萬崇華等編制的肝癌患者生命質量測定量表QOL-LC（V2.0）評分標準對入選的患者進行生活質量評分，測定治療前后兩組患者軀體功能、心理功能、癥狀/副作用、社會功能領域及生活質量總評分變化：試驗組治療后患者生活質量四個領域評分及總評分較治療前均升高（P＜0.05）。對照組治療后生活質量總評分及軀體功能、癥狀/副作用、心理功能領域評分較治療前均升高（P＜0.05），而社會功能領域評分治療前后差異無統計學意義（P＞0.05）（表5）。

4.6 血清中VEGF、HIF-1α 水平與生活質量相關性分析

治療前兩組患者血清總VEGF、HIF-1α 水平均服從正態分布，提示VEGF 與生活質量總評分間未存在顯著的相關關系，HIF-1α 與生活質量總評分間存在正向相關關系（表6、圖2、圖3）。

表5 治療前后兩組生活質量比較（）

表5 治療前后兩組生活質量比較（）

注：①與對照組治療前相比P 值；②與治療前組內相比P 值；③與治療前組內相比P值。

領域軀體功能P 0.000 0.017 0.001 0.041 0.000 0.005 0.006 0.093 0.000 0.000心理功能癥狀/副作用社會功能生活質量總評分組別試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組試驗組對照組治療前31.4±4.4①30.8±3.5 29.9±4.8①30.3±5.1 28.8±4.6①31.0±3.5 27.4±5.3①29.1±4.1 125.0±17.4①124.9±16.9治療后35.3±4.9②31.7±4.1②31.5±5.2②31.5±3.8②32.7±5.1②31.1±4.3②28.9±4.8②29.1±3.2③136.9±18.1②128.0±15.8②

表6 血清VEGF、HIF-1α水平與生活質量總評分相關性

圖2 血清VEGF水平與生活質量總評分關系

圖3 血清HIF-1α水平與生活質量總評分關系

5 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發病率和病死率均占全球的50.0%以上［5］。臨床中肝癌治療包括手術切除、肝移植、介入、靶向治療、免疫治療、放化療、中醫藥治療等。

VEGF 能特異性調控肝癌組織的血管新生。在VEGF/血管內皮細胞生長因子受體（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor，VEGFR）通路中，腫瘤細胞以旁分泌的形式使VEGF與腫瘤血管內皮細胞分泌的VEGFR 特異性結合形成二聚體后，增加血管通透性，促進內皮細胞增殖、遷移，使大量新生微血管生成并引起腫瘤遠處轉移［6］。HIF-1α 參與腫瘤糖酵解、血管生成、增殖與凋亡、侵襲轉移、微環境pH 調節等過程［7-9］。通過對小鼠肝癌細胞的培養，李偉等［10］明確了缺氧條件可誘導肝癌組織HIF-1α的高表達。

TACE后腫瘤組織局部缺血、缺氧，VEGF、HIF-1α的表達增多，TACE 術后造成瘤體局部急性缺氧，HIF-1α 高表達且性質穩定，可直接上調VEGF 的表達，促進新生血管生成，觸發不完全腫瘤壞死，促進腫瘤的復發和轉移［11］。相關研究顯示，TACE 術后 VEGF、HIF-1α 的表達高峰出現在術后1-7 天，此后逐漸下降，且治療后疾病穩定時VEGF、HIF-1α 水平與患者的臨床療效、復發情況存在相關性［12-16］。RFA 對血清VEGF 和HIF-1α 水平的影響并不明確，但在提高免疫力、減少并發癥方面有明顯作用［17］。本研究采用TACE 聯合RFA 的手段來徹底破壞影像學可見的腫瘤組織，以期達到臨床緩解率最大化的目的，進而觀察血清VEGF和HIF-1α水平的動態變化。

祖國醫學認為肝癌的發病無外乎正虛邪盛，所謂“正氣存內，邪不可干”，治療上總體以扶助正氣、祛除毒邪、消除癌癥為治療目的，祛邪兼顧扶正，正氣不虛，則祛邪效果更強。扶正消瘤顆粒的方藥組成：黃芪、菝葜、黨參、白術、白芍、丹參、鱉甲、牡蠣、貓人參、陳皮、柴胡、甘草，主要功效為益氣疏肝健脾，清熱化痰，軟堅散結，祛瘀止痛。在改善臨床癥狀、減少術后并發癥、延長生存期等方面效果顯著。

本研究中患者采用了TACE 序貫RFA 治療，中醫認為，此期患者正虛邪實，扶正消瘤顆粒在扶正的同時兼顧祛邪。研究整個治療過程中TACE 能加重腫瘤組織缺氧，血管新生增多，RFA 后缺氧情況稍改善，后缺氧情況逐漸緩解，新生血管數量也隨之減少。但這并不能說明RFA 能改善缺氧環境，可能與TACE 后阻斷了腫瘤組織的獲能途徑，腫瘤細胞大量死亡而數量減少，耗能逐漸減少相關。通過扶正消瘤顆粒用藥后觀察，試驗組兩因子水平明顯比對照組下降速度快，說明長期服用中藥扶正消瘤顆粒可以改善肝癌組織缺氧情況，抑制腫瘤血管新生，降低轉移的可能性。本研究還發現，除社會功能外，治療組在改善肝癌患者生活質量方面均優于試驗組，提示在一定程度上扶正消瘤顆粒可減輕患者乏力、疼痛、腹脹、腹瀉等不良癥狀，提高肝癌TACE聯合RFA術后患者的生活質量。相關性分析表明血清中VEGF水平與肝癌患者生活質量無明顯相關，不排除因樣本量較小，導致數據的偏差，本團隊將在下一步的研究中進一步擴大樣本量。HIF-1α 水平與肝癌患者生活質量呈正相關，這可能與HIF-1α 的雙向調節作用相關[18]，血清中的高HIF-1α水平可應激性的啟動機體保護機制，增強肝癌患者免疫力，降低不良反應，提高生活質量。

本研究證實在肝癌的血管生成關系中，HIF-1α能調控VEGF的表達，兩者呈正相關關系，同時扶正消瘤顆粒可以明顯改善TACE聯合RFA治療中肝癌組織的缺氧情況，降低HIF-1α水平，下調VEGF的表達，抑制腫瘤血管生成。對以后中醫藥輔助治療肝癌提供了有力的證據。