基于血清代謝組學(xué)技術(shù)考察通陽(yáng)化濁方與四妙勇安湯治療冠心病模型家兔的作用機(jī)制＊

梁麗喆，胡鏡清 ，吳 怡

（1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 沈陽(yáng) 110034；2. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所 北京 100700）

冠心病全名為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，是冠狀動(dòng)脈因?yàn)橹鄻佑不钠髻|(zhì)性改變導(dǎo)致管腔狹窄或阻塞，和（或）因功能性改變導(dǎo)致心肌缺氧缺血或壞死，從而引起的一類心臟疾病的統(tǒng)稱[1]。近年來(lái)，城市人群中冠心病患病人數(shù)和住院人數(shù)已上升至內(nèi)科疾病的首位[2]。目前，對(duì)于冠心病預(yù)防和治療的手段仍以藥物干預(yù)為主，研究中藥在冠心病治療中的作用機(jī)制，能夠更好的為日后的藥理學(xué)研究、冠心病臨床治療以及藥物研發(fā)提供參考[3]。

文獻(xiàn)整理結(jié)果表明，冠心病的現(xiàn)代機(jī)制研究多以內(nèi)皮反應(yīng)損傷學(xué)說(shuō)立論，而中醫(yī)藥多從“痰”“瘀”“熱”等常見(jiàn)證型入手，進(jìn)行辨證論治[4-6]。胡鏡清教授在病機(jī)兼化的理論框架下，提出的冠心病“早期濕化、中期熱化、晚期虛化”的病機(jī)，為該病的診療提供了新思路。本研究依托博士后和國(guó)家人才項(xiàng)目基金，在前期研究中，初步驗(yàn)證了清熱解毒類中藥與化痰祛瘀類中藥在冠心病（高脂合并血管內(nèi)皮損傷）模型中的降血脂、抗氧化等療效。本文通過(guò)血清代謝組學(xué)技術(shù)，再次將化濕類臨床驗(yàn)方通陽(yáng)化濁方與清熱解毒類經(jīng)方四妙勇安湯作對(duì)比，探討兩種臨床療效確切的不同類型方劑在冠心病治療起效過(guò)程中作用機(jī)制的差異[7]。

1 材料

1.1 動(dòng)物模型

40 只清潔級(jí)日本大耳兔，雄性，體質(zhì)量均為2.5-3.5 kg，購(gòu)置于青島康大生物科技有限公司。在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性喂養(yǎng)3-5天后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室溫度20℃-26℃，濕度40%-70%，實(shí)驗(yàn)室證書編號(hào)：SYXK(遼）2019-0004。

1.2 試劑與儀器

儀器分析平臺(tái)：LC-MS (Waters，Xevo G2-XS QTof)；乙腈（德國(guó)Merck 公司提供）、甲醇（德國(guó)Merck公司提供）、甲酸（中國(guó)上海CNW 公司提供）、超純水（Mili-Q）、2-氯苯丙氨酸（中國(guó)上海GL Biochem 公司提供）

2 方法

2.1 樣本采集及處理

40 只雄性白兔，隨機(jī)分為空白組、模型組、通陽(yáng)化濁方組與四妙勇安湯組4 組，每組10 只。空白組正常飲食，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)至第8 周，于第4 周結(jié)束后，用球囊法手術(shù)損傷實(shí)驗(yàn)兔的右側(cè)頸總動(dòng)脈；在模型組基礎(chǔ)上，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別在術(shù)后，灌胃給予通陽(yáng)化濁方和四妙勇安湯，連續(xù)4 周，每日1 次。給藥結(jié)束后，采取空白組與模型組病理和血液樣本，證明造模成功的前提下，模型組與實(shí)驗(yàn)組每組抽取3只家兔，促凝管采集全血后，置冰上約30 min，12000 r·min-1離心10 min，取血清300μL分裝EP管，置干冰中，用于血清代謝組學(xué)檢測(cè)。

2.2 檢測(cè)條件

2.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3，（100× 2.1 mm，1.8μm）；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：4μL；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4℃；流動(dòng)相組成A：水 + 0.1%甲酸；B：乙腈；流動(dòng)相梯度洗脫程序（表1）。

2.2.2 質(zhì)譜條件

掃描范圍：50-1200；掃描時(shí)間：0.2 s；模式：ESI+和ESI-；毛細(xì)管電壓：3 kV（ESI+）；2.5 kV（ESI-）；錐孔電壓：30 V；碰撞能量（eV）：Low CE：6，HighCE：15-45；源溫度：120℃；去溶劑化溫度：550℃；錐孔氣體流量：50 L·h-1；去溶劑化氣體流量：900 L·h-1；數(shù)據(jù)采集時(shí)間：25 min。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

2.3 生物樣品處理方法

血液樣本置于室溫解凍，用移液槍吸取100μL 樣本于 1.5 mL EP 管中，加入 300μL 甲醇，渦旋混勻30 s。-40℃靜置1 h，渦旋混勻30 s，4℃靜置0.5 h。置于4 ℃離心機(jī)中，12000 r·min-1離心15 min。取出全部上清液于離心管中，-40℃靜置1 h。置于4℃離心機(jī)中，12000 r·min-1離心15 min。吸取200μL 上清，并加入5μL 內(nèi)標(biāo)（140μg·mL-1，2-氯苯丙氨酸），轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中待LC-MS檢測(cè)。

2.4 數(shù)據(jù)處理方法

本研究在使用SMICA-P 軟件正式分析前，為獲得更加直觀可靠的結(jié)果，對(duì)數(shù)據(jù)組進(jìn)行了歸一化處理；采用PCA 的非監(jiān)督性方法和OPLS-DA 的有監(jiān)督性方法對(duì)樣本進(jìn)行建模分析，PCA 分析通過(guò)主要參數(shù)模型的解釋率R2X來(lái)判別模型質(zhì)量好壞，更真實(shí)地反映組間差異以及識(shí)別組內(nèi)變異；OPLS-DA 分析以參數(shù)R2Y來(lái)描述模型的解釋率，用Q2來(lái)表示模型的預(yù)測(cè)率，采用OPLS-DA 模型的 VIP 值，結(jié)合t檢驗(yàn)的P值，尋找不同組別的差異性表達(dá)代謝物。

3 結(jié)果

3.1 總體PCA分析

采用PCA 模型鑒定各組之間代謝產(chǎn)物的差異，PCA模型由R2X和Q2值進(jìn)行驗(yàn)證（圖1）。

結(jié)果表明：由圖1 分析可知，正模式下獲得2 個(gè)主成分，累計(jì)R2X=0.502，Q2=0.182；負(fù)模式下獲得2 個(gè)主成分，累計(jì)R2X= 0.436，Q2= 0.0772。在正模式下control 組、TYHZ 組和 SMYA 組樣品間，在負(fù)模式下control組和SMYA 組間，雖然有部分重疊，但是均有分離趨勢(shì)。QC 樣本是等量混合了所有被檢測(cè)樣本，圖中QC樣本緊密聚集，證明方法穩(wěn)定，重復(fù)性良好。

3.2 OPLS-DA分析

3.2.1 OPLS-DA得分圖

圖1 總PCA得分圖

圖2 control-TYHZ兩組的OPLS-DA得分圖

采 用 OPLS-DA 模 型 鑒 定 control-TYHZ 組 、control-SMYA 組、TYHZ-SMYA 組之間代謝產(chǎn)物的差異（圖2-4）。

結(jié)果表明：OPLS-DA 模型由 R2Y 和 Q2值進(jìn)行驗(yàn)證，參數(shù)R2Y 代表模型與數(shù)據(jù)是否匹配，參數(shù)Q2用來(lái)提供對(duì)模型的預(yù)測(cè)能力的評(píng)估。R2Y、Q2都大于0.5 表示模型有很好的解釋率和預(yù)測(cè)率，越接近1 模型的解釋能力和預(yù)測(cè)能力越好。

由圖2 分析可知，正模式下共得到1 個(gè)主成分和3個(gè)正交成分，R2X=0.863，R2Y=1，Q2=0.943；負(fù)模式下同樣得到1 個(gè)主成分和3 個(gè)正交成分，R2X=0.893，R2X= 1，Q2= 0.934。在正模式和負(fù)模式下，control 組和TYHZ組間區(qū)分明顯，所以內(nèi)源性代謝物存在差異，說(shuō)明TYHZ對(duì)于冠心病模型家兔有一定的作用。

由圖3 分析可知，正模式下可以得到1 個(gè)主成分和3 個(gè)正交成分，R2X= 0.875，R2X= 1，Q2= 0.92；負(fù)模式下同樣得到1 個(gè)主成分和3 個(gè)正交成分，R2X =0.855，R2X= 1，Q2= 0.732。在正模式和負(fù)模式下，control 組和SMYA 組間區(qū)分明顯，所以內(nèi)源性代謝物存在差異，說(shuō)明SMYA 對(duì)于冠心病模型家兔有一定的作用。

由圖4 分析可知，正模式下可以得到1 個(gè)主成分和3個(gè)正交成分，R2X=0.853，R2X=1，Q2=0.995；負(fù)模式下同樣得到1 個(gè)主成分和3 個(gè)正交成分，R2X=0.851，R2X= 1，Q2= 0.865。在正模式和負(fù)模式下，SMYA 組和TYHZ 組間區(qū)分明顯，所以內(nèi)源性代謝物存在差異，說(shuō)明TYHZ 和SMYA 對(duì)于冠心病模型家兔均有一定的作用。

圖3 control-SMYA組的OPLS-DA得分圖

圖4 TYHZ-SMYA組的OPLS-DA得分圖

3.2.2 OPLS-DA 3D-score圖

圖 5、圖 6、圖 7 分別為 control-TYHZ 組、control-SMYA 組和TYHZ-SMYA 組，其代謝物譜經(jīng)OPLS-DA處理后得到的3D-score圖。

3.2.3 OPLS-DA載荷圖

結(jié)果表明：載荷圖圖中的每個(gè)點(diǎn)分別代表樣本中檢測(cè)到的一個(gè)代謝物信息，其距離中心原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明該代謝物對(duì)各樣本組間的分離貢獻(xiàn)度越大，就越有可能是潛在的生物標(biāo)志物。

在圖8 通陽(yáng)化濁方與模型組的比較中，代謝物信息多聚集于離中心較遠(yuǎn)處，提示潛在生物標(biāo)志物較多；圖9 四妙勇安湯與模型組次之，圖10 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組間潛在的差異性生物標(biāo)志物較少。

3.3 差異物質(zhì)表

3.3.1 通陽(yáng)化濁方與模型組比較

本研究中，為了探究通陽(yáng)化濁方對(duì)冠心病（內(nèi)皮損傷且高脂）模型的影響，將通陽(yáng)化濁方與模型組比較，共篩選出45個(gè)差異化合物（表2）。

將上述鑒定出的差異化合物輸入MetaboAnalyst（http://www. metaboanalyst.ca/）數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行代謝通路分析（表3、圖11）。

結(jié)果顯示：control-TYHZ 組一共涉及18 條代謝通路，根據(jù)Impact值＞0.05 篩選出5 條主要代謝通路，即精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸代謝、牛磺酸和牛磺酸代謝、精氨酸生物合成和α-亞麻酸代謝。提示在血清中通陽(yáng)化濁方對(duì)冠心病（內(nèi)皮損傷合并高脂）模型的影響可能與這5 條代謝通路相關(guān)，影響這些代謝通路可能會(huì)對(duì)通陽(yáng)化濁方在冠心病模型中作用產(chǎn)生影響。

圖5 control-TYHZ兩組的OPLS-DA 3D-score圖

圖6 control-SMYA兩組的OPLS-DA 3D-score圖

圖7 TYHZ-SMYA兩組的OPLS-DA 3D-score圖

圖8 control-TYHZ兩組的OPLS-DA載荷圖

圖9 control-SMYA兩組的OPLS-DA載荷圖

圖10 TYHZ-SMYA兩組的OPLS-DA載荷圖

3.3.2 四妙勇安湯與模型組比較

本研究中，為了探究四妙勇安湯對(duì)內(nèi)皮損傷的高脂模型的影響，將四妙勇安湯與模型組比較，共篩選出27個(gè)差異化合物（表4）。

將上述鑒定出的差異化合物輸入MetaboAnalyst（http://www.metaboanalyst.ca/）數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行代謝通路分析（表5和圖12）。

結(jié)果顯示：control-SMYZ 組一共涉及11 條代謝通路，根據(jù)Impact值＞0.05 篩選出2 條主要代謝通路，即牛磺酸和牛磺酸代謝和組氨酸代謝。提示在血清中四妙勇安湯對(duì)內(nèi)皮損傷的高脂模型的影響可能與這2條代謝通路相關(guān)，影響這些代謝通路可能會(huì)對(duì)四妙勇安湯對(duì)內(nèi)皮損傷的高脂模型產(chǎn)生影響。

表2 control-TYHZ組血清樣本差異物質(zhì)列表

表3 control-TYHZ組血清樣本代謝途徑列表

圖11 control-TYHZ血清組代謝途徑分析結(jié)果

4 討論

在理論基礎(chǔ)方面：胸痹之為病，大體脾虛運(yùn)化水濕不利，久則聚濕成痰，痰濁壅遏中焦，蒙蔽胸陽(yáng)，陽(yáng)氣不得疏布而致。本研究針對(duì)冠心病較為公認(rèn)的“濕濁”與“熱毒”兩個(gè)病理因素，通過(guò)“化濕”與“清熱解毒”兩類中藥干預(yù)的對(duì)比，探討其在治療冠心病過(guò)程中起效的不同作用途徑，為研究中冠心病“早期濕化、中期熱化、晚期虛化”的理論假說(shuō)提供數(shù)據(jù)支持。

表4 control-SMYZ組血清樣本差異物質(zhì)列表

在用藥選擇方面：通陽(yáng)化濁方為路志正國(guó)醫(yī)大師的臨床驗(yàn)方。路志正國(guó)醫(yī)大師致力于推廣脾胃學(xué)說(shuō)，提出“持中央、運(yùn)四旁”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，為冠心病治療提供了中醫(yī)診療思路[8-10]。方中廣藿香辛而微溫，專入脾胃，以其芳香化濁，和中祛濕，宣散濕濁中阻，消解胸悶脘痞，為君藥。厚樸、枳實(shí)味辛苦，亦歸脾胃，兩藥相須為用，辛開(kāi)苦降，善燥濕化痰，寬胸散結(jié)，行氣消痞，以助君藥?kù)钐祷瘽幔駣^中焦，疏布胸陽(yáng)之力，合為臣藥。另取苦杏仁降氣祛痰而寬胸；茵陳清利而導(dǎo)濕下行；郁金行氣活血而止痛，合而祛痰濕，行瘀滯，寬胸膈，蠲痹痛，共為佐藥。本劑寒溫合用，性偏溫和。袪痰化濁，振奮脾胃，消除陰霾而治其本；化瘀行滯，寬胸散結(jié)，通陽(yáng)蠲痹而理其標(biāo)。六味合用，共奏祛痰化濁，寬胸散結(jié)，通陽(yáng)蠲痹之效。四妙勇安湯以治療熱毒熾盛證見(jiàn)長(zhǎng)，臨床應(yīng)用較為廣泛，基于抗炎、抗氧化、調(diào)血脂、抗血栓、改善血液流變等臨床藥理作用，其在冠心病治療中的應(yīng)用研究引起關(guān)注[11-15]。方中金銀花清熱解毒，重為君藥；玄參清熱涼血，瀉火解毒，當(dāng)歸活血化瘀，與玄參合用養(yǎng)血滋陰而生新，共為臣藥；生甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥，自為佐使。

表5 control-SMYZ組血清樣本代謝途徑列表

圖12 control-SMYZ血清組代謝途徑分析結(jié)果

在方法選擇方面：代謝組學(xué)技術(shù)由Nicholson 在1999 年首次提出，它是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后，系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。由于代謝組學(xué)可以使用尿液或血液做無(wú)損的連續(xù)取樣，通過(guò)大規(guī)模信息提取技術(shù)，觀察疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化，揭示人體內(nèi)部各組成成分相互作用和運(yùn)行規(guī)律，在中藥復(fù)方藥理學(xué)研究方面，與中醫(yī)“整體觀”“動(dòng)態(tài)觀”“辨證觀”相吻合，對(duì)探討疾病早期診斷與初步療效的生物標(biāo)志物，具有明顯優(yōu)勢(shì)[16，17]。

在代謝途徑方面：牛磺酸和牛磺酸代謝、組氨酸代謝是通陽(yáng)化濁方與四妙勇安湯共同涉及的兩條主要代謝通路，除此之外，通陽(yáng)化濁方的代謝還與精氨酸和脯氨酸代謝、精氨酸生物合成以及α-亞麻酸代謝通路相關(guān)。既往研究表明，牛磺酸作為游離氨基酸中的一員，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠通過(guò)清除自由基，改善冠心病患者血管內(nèi)皮的舒張功能，從而減少心肌受損，在冠心病，特別是痰瘀或瘀熱互結(jié)證患者中，血液含量明顯低于正常人[18，19]；脫羧酶催化組氨酸生成組胺，大量組胺可誘導(dǎo)冠脈收縮，還可擾亂心肌內(nèi)皮和線粒體功能，其釋放水平與冠心病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，用藥后組氨酸水平的降低，提示CHD 的心肌缺血程度減輕[20-22]；精氨酸在冠心病中的作用，主要通過(guò)二甲基精氨酸二甲胺水解酶-非對(duì)稱性二甲基精氨酸（DDAH-ADMA）系統(tǒng)，來(lái)抑制NOS 生物利用度，精氨酸和ADMA 的降低，可以一定程度上維持及穩(wěn)定血管內(nèi)皮功能，減少冠心病的發(fā)生[23-25]；脯氨酸參與蛋白質(zhì)氨基酸的代謝過(guò)程，可作為判斷是否冠心病血瘀證的主要物質(zhì)，能夠區(qū)分氣虛血瘀與其他血瘀證，與冠心病血瘀證發(fā)生成負(fù)相關(guān)[26-28]；α-亞麻酸屬于多不飽和脂肪酸（ω3-PUFAs），是人體必需脂肪酸，它可通過(guò)減弱對(duì)血管平滑肌刺激或影響前列腺素生成而起到降壓作用，有研究報(bào)道，不飽和脂肪酸可降低冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)性脂肪酸含量降低與CHD 密切相關(guān)[29，30]。

5 小結(jié)

血清代謝組學(xué)技術(shù)具有直接、無(wú)創(chuàng)、靈敏度高的顯著優(yōu)勢(shì)，與中醫(yī)整體觀念有異曲同工之妙。本研究通過(guò)血清代謝組學(xué)的研究方法，篩選了通陽(yáng)化濁方與四妙勇安湯在治療冠心病模型家兔的過(guò)程中存在差異性代謝產(chǎn)物，提示干預(yù)相應(yīng)的代謝通路，可能會(huì)對(duì)藥物在模型中的作用產(chǎn)生影響。