白藜蘆醇葡萄糖苷的生物合成

王書元，張雨彤，楊芳，于曉海，陳慧，金建明*

北京工商大學植物資源研究開發北京市重點實驗室（北京 100048）

白藜蘆醇也稱3, 4', 5-三羥基芪、虎杖苷元、茋三酚和芪三酚等，是一種多酚類化合物，具有順、反2種結構。天然的白藜蘆醇為反式結構（圖1）。白藜蘆醇主要存在于葡萄屬、蓼屬、花生屬和藜蘆屬等植物中。白藜蘆醇分子結構中存在3個酚羥基，在溶液中易被氧化。但白藜蘆醇難溶于水。研究表明白藜蘆醇有很好的生物活性，具有抗衰老、抗腫瘤、防治心血管疾病，以及抗菌、抗氧化和免疫調節等生物活性[1-5]。白藜蘆醇被廣泛應用于食品、保健品、化妝品等領域。

圖1 白藜蘆醇分子結構式

雖然白藜蘆醇的生物活性在全球范圍內得到認可，但白藜蘆醇仍存在水溶性差和容易氧化等問題[6]。在研究白藜蘆醇的生物合成時也發現其水溶性很差而且易氧化[7]。白藜蘆醇的糖基化衍生物不僅有助于提高其水溶性和防止其氧化，也可提高其生物利用度[6]。但由于白藜蘆醇的酚羥基比較活潑，糖基化反應很難通過化學合成進行，而且難以解決化學合成過程中糖基的手性問題。因此通過基因工程克隆表達葡萄糖基轉移酶催化白藜蘆醇合成其葡萄糖苷是最佳選擇。在工程菌中克隆并改造葡萄糖基轉移酶，提高其催化合成兒茶素、大豆苷元、金雀異黃酮和水飛薊賓的葡萄糖苷的效率[8]。試驗克隆一個淀粉蔗糖酶（AS），初步研究其催化白藜蘆醇合成白藜蘆醇葡萄糖苷的性質，為進一步改造該葡萄糖基轉移酶高效合成白藜蘆醇葡萄糖苷和研究白藜蘆醇葡萄糖苷的生物活性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

中度嗜熱菌Deinococcus geothermalis（中國科學院微生物研究所中國普通微生物菌種保藏管理中心）；大腸桿菌Escherichia coli MC1061和BL21和質粒pET-28a（實驗室保存）。

1.1.2 試劑耗材

Pyrobest DNA Polymerase和rTaq聚合酶（寶生物工程（大連）有限公司）；限制性內切酶NdeI和XhoI、T4 DNA連接酶（New England Biolabs公司）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒純化試劑盒（Omega Bio-Tek公司）；BCA蛋白質定量試劑盒（北京康潤誠業生物科技有限公司）；蛋白質marker（Thermo Scientific公司）；異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl βd-thiogalactoside，IPTG，亞辰博奕科技（北京）有限公司）；葡聚糖凝膠（GE公司）；硅膠、硅膠板（青島海洋化工廠）；甲醇、乙酸乙酯等化學試劑（均為分析純）。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構建和轉化[9]

培養中度嗜熱菌D. geothermalis，提取基因組DNA。根據文獻設計一對引物：pET-NdeI-GAS-F（5'-CATATGCTGAAAGACGTGCTCACT-3'）和pETXhoI-GAS-R（5'-CTCGAGTGCTGGAGCCTCCCCGGCGGT-3'）。以中度嗜熱菌D. geothermalis基因組DNA為模板，pET-NdeI-GAS-F和pET-XhoI-GAS-R為PCR引物，用Pyrobest DNA Polymerase擴增得到基因dgas。PCR擴增條件為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min，55 ℃1 min，72 ℃ 2 min，反復循環30次，72 ℃ 5 min。PCR產物經凝膠電泳檢測觀察到預期的DNA分子條帶，并用PCR純化試劑盒純化目的基因dgas DNA。把純化目的基因dgas DNA和空質粒pET-28a分別用NdeI和XhoI進行雙酶切反應，酶切后的DNA經凝膠電泳和凝膠DNA回收試劑盒回收純化。把2段回收的DNA按2︰1混合后加入T4 DNA連接酶，在16 ℃反應過夜。連接生成的質粒pET-DGAS通過電擊轉化法轉入感受態大腸桿菌MC1061細胞。復蘇后涂布于已加入卡拉霉素的LB平板中。37 ℃過夜培養后挑取8個單克隆菌落，用rTaq聚合酶進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。產生預期DNA分子條帶的單克隆菌落再分別接種于3 mL含卡拉霉素的LB培養液中，在37 ℃，以250 r/min振蕩培養12 h以上。按照質粒提取試劑盒說明提取質粒并測序。測序正確的質粒pET-DGAS再經電轉化轉入大腸桿菌BL21中。在卡拉霉素抗性的LB平板中37 ℃培養過夜得到單克隆。

1.2.2 DGAS的誘導表達、純化和鑒定[8]

從平板中挑取的單菌落及帶有空質粒pET-28a的菌株，分別接種到滅菌的含卡拉霉素的LB培養液中。接種的培養液在溫度37 ℃，轉速250 r/min下培養7～8 h，測定菌液OD600nm值，OD600值為0.6～0.8時，加入IPTG，在30 ℃，以250 r/min誘導培養10～12 h。

誘導表達培養好的菌液在4 ℃，5 000×g離心5 min，棄上清，菌體沉淀用體積1/10的培養液1 mol/L磷酸鉀緩沖液重懸，置于冰浴中間隔超聲破碎細胞。超聲條件為超聲時間5 s，超聲間隔時間5 s，超聲時間3 min/mL。超聲后的溶液在4 ℃，以17 000×g離心10 min。取上清即為粗酶液。

粗酶液經SDS-PAGE和酶活力檢測確定后，用Ni-NTA柱純化DGAS。根據粗酶液中DGAS的表達量選擇Ni-NTA的量。粗酶液經Ni-NTA柱后，用10 mmol/L的咪唑洗脫，再用20 mmol/L的咪唑洗脫目標蛋白DGAS，小量分管收集，經考馬斯亮藍法測定蛋白濃度和DNS法測定DGAS酶活力。經SDS-PAGE檢測純化的DGAS及其純度。

1.2.3 SDS-PAGE

SDS-PAGE所用的分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%。16 μL蛋白樣品中加入4 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻后煮沸10 min，冷卻后12 000×g離心10 min。取上清5 μ L上樣。電泳條件為80 V電泳30 min，120 V電泳1 h。剝離取出的凝膠在考馬斯亮藍R250染色液中染色2 h，用脫色液中脫色，直到凝膠顏色完全脫去，觀察到凝膠中清晰的蛋白條帶。

1.2.4 DNS法測定DGAS酶活力[8]

將150 μ L酶液和150 μ L含0.2 mol/L蔗糖的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液混合，于37 ℃反應30 min，取出100 μL反應液再加入100 μL DNS試劑，混合均勻后沸水浴煮5 min。冷卻后測定OD540nm值。

1.2.5 DGAS催化白藜蘆醇產生糖基化產物反應[10]

催化反應在100 mmol/L磷酸鉀緩沖液1 mL中進行。含25 mmol/L的白藜蘆醇底物（DMSO溶解）和100 mmol/L的蔗糖，500 μL酶液或未導入質粒PET28a的粗酶液作為空白對照。反應溫度為37 ℃，保溫反應3，6，12和24 h后分別取樣，于50 ℃加熱2 h，使酶失活以終止反應。反應產物先用TLC顯色檢測確定，通過HPLC進一步檢測分析白藜蘆醇及其糖基化產物確定最佳反應時間為3 h。

1.2.6 白藜蘆醇及其糖基化產物的HPLC檢測分析[7]

HPLC運行在島津LC-20AT液相色譜儀器；色譜柱為C18反相分析柱（公司Waters，型號Symmetry，介質顆粒大小5.0 μm，規格4.6 mm×250 mm）；柱溫45℃；35%乙腈（0.1%甲酸），流速0.5 mL/min，檢測波長305 nm。

1.2.7 白藜蘆醇糖基化產物的分離純化

大規模催化反應總體積為400 mL。其中，含20 mmol/L白藜蘆醇底物（1.83 g，DMSO溶解）和100 mmol/L的蔗糖，以及200 mL酶液。在37 ℃保溫反應3 h。再50 ℃加熱2 h以終止反應。反應液在8 000 g下離心5 min，上清液用抽濾瓶進行抽濾。在50 ℃用旋轉蒸發儀真空濃縮。硅膠拌樣后進行硅膠柱層析，用含0.5%乙酸的乙酸乙酯-甲醇（20︰1，V/V）至甲醇進行梯度洗脫。收集白藜蘆醇糖基化產物部分，濃縮后進行葡聚糖凝膠柱層析，用30%甲醇至100%甲醇梯度洗脫得到化合物1（256 mg）和2（89 mg）。

1.2.8 化合物1和2的NMR條件

純化的2個白藜蘆醇糖基化產物溶解在氘代甲醇（MeOD），以四甲基硅烷（TMS）作為內標，在Bruker Avance 400 MHz核磁共振波譜儀上分析得到1H，13C和2D NMR譜圖。

1.2.9 化合物1的溶解度檢測[8]

在室溫條件下配置白藜蘆醇和化合物1的過飽和水溶液，置于密封的1.5 mL離心管。在搖床中25 ℃，以250 r/min振蕩24 h。離心管在25 ℃，17 000×g離心5 min。上清液經過0.22 μ m濾膜過濾。采用HPLC檢測飽和水溶液中白藜蘆醇和化合物1含量。

2 結果與分析

2.1 DGAS的表達

從中度嗜熱菌D.geothermalis中通過PCR克隆的基因dgas經凝膠電泳檢測符合預期的DNA大小（約2.0 kb）。純化的該基因DNA經內切酶完全消化后連接后載體pET-28a，再轉入轉化效率高效的大腸桿菌MC1061。從卡拉霉素抗性平板上挑取8個單菌落經PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證有6個單克隆擴增到預期的DNA條帶。從這6個單克隆提取的質粒經測序證明都插入正確的基因dgas。插入正確基因dgas的質粒再轉入大腸桿菌BL21，誘導表達后超聲破細胞的粗酶液經DNS法檢測確定克隆的DGAS具有催化水解蔗糖產生果糖的活性。在SDS-PAGE上，含插入基因dgas的質粒pET-DGAS的菌株的蛋白條帶明顯比含空質粒的菌株經誘導表達后多出一粗條帶。同時，SDS-PAGE結果顯示純化的DGAS的分子量為73.0 kDa（圖2），這與預期一致。表明克隆的基因dgas在大腸桿菌中成功表達。

圖2 SDS-PAGE

2.2 DGAS催化白藜蘆醇生成白藜蘆醇糖基化產物

純化的DGAS在磷酸鉀緩沖液中催化白藜蘆醇反應的TLC結果表明，在白藜蘆醇的顯色帶下方出現其他與白藜蘆醇顯色相同的條帶。采用HPLC檢測也證明催化反應產生其他化合物。空質粒的菌株的酶液（圖3A）經HPLC檢測只出現白藜蘆醇（峰3，保留時間11.8 min）。DGAS催化白藜蘆醇的反應液的HPLC檢測譜圖顯示，除了白藜蘆醇（峰3）外，還出現2個化合物1（峰1，保留時間6.3 min）和2（峰2，保留時間5.5 min）（圖3B）。另外，一定比例的DGAS粗酶液催化白藜蘆醇和蔗糖反應，反應液經HPLC檢測也表明催化反應生成這2個化合物1和2。催化反應3，6，12和24 h后，反應液的HPLC檢測也都表明多了這2個化合物，而且化合物1和2的濃度變化不大。表明在催化反應3 h后催化反應幾乎達到平衡。

通過大規模培養制備DGAS，并以蔗糖為葡萄糖基為供體，白藜蘆醇為受體，進行大規模催化反應。反應液經硅膠柱層析先洗脫除去白藜蘆醇，白藜蘆醇糖基化產物經葡聚糖凝膠LH20柱層析得到2個化合物1和2。化合物1和2經HPLC檢測分析確定為DGAS催化白藜蘆醇反應產生的2個化合物（圖3B、C和D）。

圖3 HPLC檢測分析白藜蘆醇糖基化產物

2.3 化合物1和2的結構鑒定

化合物1的1H NMR譜圖顯示，其存在1個糖基端基碳的質子信號峰δ5.49。耦合常數J=2.8 Hz表明該糖基為α-構型。其13C NMR譜圖也表明，除了白藜蘆醇的碳信號峰，化合物1明顯存在1個葡萄糖基的6個碳特征峰。結合2D NMR，歸屬化合物1的1H和13C的所有化學位移（表1）。在HMBC譜圖上，葡萄糖基端基碳的質子信號峰δ5.49與碳信號δ158.3相關，表明葡萄糖基與苷元白藜蘆醇的C4'位上的羥基相連接。因此，化合物1的結構鑒定為白藜蘆醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物2的1H NMR譜圖表明有2個糖基端基碳的質子信號峰δ5.50（d，J=1.9 Hz）和5.21（d，J=1.9 Hz）。耦合常數J=1.9 Hz表明這2個糖基都為α-構型。其13C NMR譜圖也表明，除了白藜蘆醇的碳信號峰，該化合物明顯存在2個葡萄糖基的12個碳信號峰。結合2D NMR，歸屬了化合物2的1H和13C的所有化學位移（表1）。在HMBC譜圖上，葡萄糖基端基碳的質子信號峰δ5.50與碳信號δ157.7相關，表明葡萄糖基與苷元白藜蘆醇的C4'位的羥基相連接；另一個葡萄糖基端基碳的質子信號峰δ5.21與碳信號δ84.3相關，表明該葡萄糖基與內側的葡萄糖基的C4為的羥基連接。因此，化合物2的結構鑒定為白藜蘆醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖苷。

表1 化合物1和2的NMR數據

2.4 化合物1的溶解度

在25 ℃溫度下，配置化合物1的過飽和溶液，經HPLC檢測分析，化合物1的溶解度為2.26 mg/mL。在純水中，白藜蘆醇由于溶解度太低，經HPLC很難檢測計算其溶解度。

3 討論

白藜蘆醇的生物活性具有廣譜性，但由于其含有2個苯環結構，使得其在水溶液中溶解度比較低。而白藜蘆醇糖基化產物將極大的提高其溶解度。淀粉蔗糖酶（AS）是葡萄糖基轉移酶（Glycosyltransferase，E.C.2.4.1.4）的一種，屬于糖苷水解酶（GH）13家族[11]。該類酶具有水解蔗糖的葡萄糖基并把水解下來的葡萄糖基轉移到供體上的特性。來自中度嗜熱菌D.geothermalis的淀粉蔗糖酶DGAS已經被證明能催化氫醌合成熊果苷[10]。因此，試驗克隆中度嗜熱菌D.geothermalis的DGAS研究其催化合成白藜蘆醇葡萄糖苷的能力。從中度嗜熱菌D.geothermalis克隆的DGAS能在大腸桿菌BL21誘導表達，經SDS-PAGE證明其分子量符合預期，并且經DNS法檢測DGAS具有水解蔗糖活性。因此，確定成功克隆表達DGAS。

以蔗糖為葡萄糖基供體，白藜蘆醇為受體，經HPLC檢測分析DGAS能夠催化生成2個白藜蘆醇葡萄糖苷，但是轉化效率并不是很高。由于白藜蘆醇有3個酚羥基，因此需確定葡萄糖基連接在哪個酚羥基及葡萄糖苷鍵的構型。因此，通過大規模反應制備和純化這2個白藜蘆醇葡萄糖苷。由于反應液中白藜蘆醇的含量比較高，用硅膠柱層析先洗脫除去白藜蘆醇，把2個白藜蘆醇葡萄糖苷洗脫下來。由于該2個化合物通過硅膠柱層析很難分離純化而且在反相硅膠C18柱層析也很難分離純化，而通過葡聚糖凝膠LH20柱層析容易純化這2個化合物。通過NMR確定這2個白藜蘆醇葡萄糖苷的葡萄糖基都為α-構型，符合DGAS的催化性質[11]。葡萄糖基只連接在白藜蘆醇的4'位的羥基表明DGAS不能催化白藜蘆醇的3位和5位的羥基糖基化，即DNAS能催化白藜蘆醇對位的酚羥基，不能催化間位的酚羥基。因此，推斷DGAS以蔗糖為葡萄糖基為供體，先轉移1個葡萄糖基到白藜蘆醇的4'位的羥基生成白藜蘆醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷，轉移1個葡萄糖基到白藜蘆醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷的糖基4位羥基上生成白藜蘆醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖苷（圖4）。

比較研究白藜蘆醇和白藜蘆醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷的水溶性過程中，發現采用HPLC通過紫外吸收法難以檢測白藜蘆醇的溶解度。這可能是由于白藜蘆醇在水中溶解度太低以致儀器難以檢測到。白藜蘆醇葡萄糖苷在水中的溶解度很容易通過HPLC檢測得到。根據文獻報道，白藜蘆醇在水中的溶解度為0.03 mg/mL[6]。因此，與白藜蘆醇在水中的溶解度相比較，白藜蘆醇葡萄糖苷大幅度提高了其水溶性。

圖4 DGAS催化白藜蘆醇生成化合物1和2

4 結論

中度嗜熱菌D. geothermalis的淀粉蔗糖酶DGAS能以蔗糖為葡萄糖基供體，催化白藜蘆醇合成2個白藜蘆醇葡萄糖苷，即白藜蘆醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷和白藜蘆醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖苷。另外，產生的白藜蘆醇-4'-O-α-D-吡喃葡萄糖苷的水溶性比白藜蘆醇的大很多。