基于多元素和穩定同位素的特基拉酒原產地鑒定

張建 ，馬義虔 ，田玲*，邵飛龍 ，盧垣宇 ，陳興林

1. 貴州省產品質量監督檢驗院（貴陽 550016）；2. 國家酒類及加工食品質量監督檢驗中心（貴陽 550016）；3. 深圳職業技術學院（深圳 518055）

特基拉酒（Tequila）是以墨西哥4個法定州（哈利斯科Jalisco、瓜納華托州Guanajuato、米卻肯州Michoacan、塔毛利帕斯Tamaulipas）內種植的藍龍舌蘭（Blue agave）為原料，經過蒸餾制作而成的一款蒸餾酒。2014年中國市場對墨西哥特基拉酒開放，承認墨西哥特基拉酒的原產地（地理標志）商標。中國對特基拉酒的進口量和消費量呈穩步增長趨勢，出現不法商家以假亂真或以次充好現象，導致國內市場的特基拉酒質量參差不齊，品質和定價脫節。為此發展有效、快速、準確的鑒別特基拉酒產地和品質的新技術成為亟待解決的問題。

礦質元素指紋法[1-4]，香氣指紋法[5]和穩定同位素質譜（IRMS）技術[6-8]等被應用于食品領域，其中穩定同位素比值法能很好地指示地域和氣候特征，其廣泛應用在食品產地溯源（如葡萄酒[9]、牛肉[10]和茶葉[11-12]）和真偽鑒別（如釀造醬油[13]和蜂蜜[14-15]）等領域。特基拉酒中礦質元素的含量與其生長環境（如土壤、水、氣候）等密切相關，他們不易在釀造、陳釀過程中代謝或者改變，因此也是特基拉酒產地辨別的重要標識物。Bontempo等[16]用49種礦物質元素結合C、N、O、S、Sr穩定同位素比值對阿爾卑斯地區的10個奶酪樣本進行原產地識別，樣品正確歸類率為94%。邵圣枝等[17]采用23種礦物元素含量和C、N、O、H穩定同位素比值結合化學計量學中主成分分析（PCA）和線性判別分析（LDA）對黑龍江省、江蘇省和遼寧省23個稻米樣本進行判別驗證，正確率達91%。袁玉偉等[11]采用27種礦物元素含量和C、N、O、H穩定同位素比值，并結合化學計量學PCA-LDA對福建、山東、浙江產地茶葉的判定準確率為99%，說明利用穩定同位素和礦物元素結合化學計量學的方法能較好地進行茶葉產地溯源。

采用礦物元素和穩定同位素比值，并結合化學計量學中主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），建立對墨西哥4個法定產區特基拉酒進行產地溯源和判別的方法，為中國進口墨西哥特基拉酒的原產地保護和真偽鑒別提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DRC-e電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS，美國Perkin Elmer公司）；DELTA V Plus同位素質譜儀（IRMS，配備Trace GC氣相色譜儀，儀器控制軟件為ISODATE 3.0，美國Thermo Fisher公司）；GasBench II前處理裝置：GC PAL自動進樣器，PoraPlot Q色譜柱（25 m，0.32 mm），螺旋蓋樣品瓶，進樣針和吹氣針；氣相色譜柱（RTX-WAX，30 m×0.25 mm×0.25 μ m）。

炭黑中碳同位素標準物質δ13CVPDB=-3.691%±0.010%；氫氧同位素水標準物質GBW 04458：δ18OVSMOW=-0.015%±0.007%，GBW 04459：δ18OVSMOW=-0.861%±0.008%；高純氦氣（99.999%）；標準參考氣CO2（中國盛盈公司）；多元素標準溶液（美國Perkin Elmer公司）；Milli-Q Gradient純水處理系統（法國Millipore公司）。

1.2 材料

特基拉酒主要委托進口商從墨西哥4個法定產區購買原瓶原裝：Jalisco 13支、Guanajuato 15支、Michoacan 15支、Tamaulipas 17支。4個產區共60支樣本（44支特基拉酒用于產地溯源模型的建立，16支用于模型的驗證）。

1.3 樣品前處理

取特基拉樣品25 mL，100 ℃水浴揮干酒精后用1%硝酸定容至25 mL，用于多元素分析[18]；取20 μL特基拉酒樣品放入氣相色譜瓶中，加入1 mL色譜純丙酮，用于乙醇穩定碳同位素比值分析；取0.5 mL特基拉酒樣品，放入螺旋蓋樣品瓶中，充入0.3% CO2和He混合氣300 s，帶走瓶中的空氣，平衡18～24 h，使氣體CO2與水中氧發生同位素交換，用于分析水中穩定氧同位素。

1.4 儀器條件

1.4.1 ICP-MS測定條件[18]

RF功率1 100 W；霧化器流速0.88 L/min；冷卻氣流速16 L/min；輔助氣流速1.2 L/min；離子透鏡電壓6 V。砷元素的測定采用動態反應池模式，設定參數為Cell gas A 0.3；RPq 0.5。

1.4.2 IRMS測定條件

1.4.2.1 穩定碳同位素測定條件

色譜柱RTX-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣量1 μL；載氣，高純He；流速1.2 mL/min；分流比30︰1；進樣口溫度200 ℃；升溫程序為，起始溫度40 ℃，持續5 min，以10 ℃/min速率上升至80 ℃，在80 ℃保持1 min，以25 ℃/min速率上升至200 ℃，200℃保持15 min；燃燒管溫度1 000 ℃，切入質譜時間200 s；離子源電壓2.97 kV，真空度1.6×10-6mBar；轟擊電壓123.8 eV。

1.4.2.2 穩定氧同位素測定條件

載氣，氦氣；載氣壓力，0.9 bar；參考氣，CO2；參考氣壓力，1.3 bar；柱溫，65 ℃；色譜柱，PoraPlot Q；離子源電壓，2.97 kV；真空度，1.6×10-6mBar；轟擊電壓，123.8 eV。

1.5 數據處理

Thermo Electron Isodat Version 3.0軟件用于同位素比值的計算和數據獲取。主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）采用R語言進行分析。繪圖軟件采用Origin 9.0（美國，Originlab）進行數據圖繪制。

2 結果與討論

2.1 精密度和準確性

在前期研究中[18]，通過加標回收試驗考察ICPMS測定特基拉酒中22種元素的精密度和準確度，各待測元素的加標回收率均處于90%～110%，與前期研究食品中鉛、砷、汞、鎘、鋇、鉻、銀、鎳8種元素的結果一致[19]，表明ICP-MS能滿足各元素的檢測要求。

根據國際檢測方法質量控制要求[20]，質控標準品和樣品δ13C值測定偏差分別不超過0.05%和0.03%。通過使用炭黑標準物質和氫氧同位素水標準物質對參考氣CO2進行碳同位素和氧同位素標定，如表1所示，參考氣CO2的δ13C值測定的標準偏差為0.001 6%，氧同位素比值δ18O測定的標準偏差小于0.006%，滿足試驗的檢測要求。

采用同一個樣品重復考察試驗方法的準確度。按照試驗條件和步驟，同一個樣品中乙醇的碳同位素比值用GC-IRMS重復測定8次，同一個樣品中水的氧同位素比值用GasBench Ⅱ-IRMS重復測定8次，并計算標準偏差，結果如表2所示，特基拉酒中乙醇的δ13C值和水的δ18O值測定的標準偏差分別為0.012%和0.003%，滿足試驗準確度要求。

表1 標準物質的δ13C值和δ18O值精密度測定結果*

表2 IRMS測定特基拉酒中乙醇δ13C值和水δ18O值的準確度*

2.2 產地溯源分析

為了檢測特基拉酒中多元素含量和碳、氧穩定同位素比值分析在特基拉酒產地溯源中的有效性，選取墨西哥4個法定產區（Jalisco、Guanajuato、Michoacan、Tamaulipas）的特基拉酒，利用該方法分別測定特基拉酒中多元素含量、乙醇的碳同位素比值和水的氧同位素比值。分析結果表明，不同產地特基拉酒的多元素含量（見參考文獻中表4）[18]、碳和氧同位素比值（見表3）存在差異，說明特基拉酒的多元素含量、碳和氧同位素比值成分具有產地差別，能用于產地溯源分析。

2.3 模型建立

依據對特基拉酒4個產區的特基拉酒中穩定碳同位素δ13C、氧同位素δ18O的單因素方差分析的結果，以及22種金屬元素含量的主成分分析結果，對金屬元素得出的6種主成分分析結果進行方差分析，均存在顯著性差異，由此可通過產地溯源模型構建，并利用構建的模型進行產地判別。對Guanjuat、Jalisco、Michoaca和Tamaulip 4個產區的44個樣品中測定得到穩定同位素和金屬元素的數據進行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），構建模型，結果見圖1和圖2。

通過穩定碳、氧同位素和多元素分析可將4個地區的特基拉酒有效分開，但是Tamaulip地區集中在PC1和PC2的負半軸形成的區域，而剩下的3個地區Guanjuat，Jalisco和Michoaca集中在PC1的正半軸的區域內，但是都能分開，效果較好。

表3 特基拉酒中乙醇δ13C和水δ18O測定結果

圖1 墨西哥特基拉酒產地鑒別PLS-DA模型的二維圖

圖2 墨西哥特基拉酒產地鑒別PLS-DA模型的二維圖

2.4 模型驗證

由表4可以看出，Guanjuat地區的樣品1個被誤判為Tamaulip地區，預測準確率75%，而其他3個產區均判別準確，預測準確率100%。因此可以看出該模型整體可靠，其模型的總體預測準確率93.75%。可通過繼續加大樣品采集量，構建更加龐大數據庫，爭取和墨西哥特基拉酒相關實驗室達成技術合作，采集更多關于當地龍舌蘭以及特基拉酒更多技術信息，如當地氣候資料、當地地表水中氧同位素數據等，構建更加可靠，信息量大，更接近當地真實情況。

表4 墨西哥特基拉酒4個產區溯源PLS-DA模型驗證

3 結論

通過對特基拉酒中乙醇的穩定碳同位素δ13C和特基拉酒中水的穩定氧同位素δ18O測定的數據及利用ICP-MS對特基拉酒中22種金屬元素的測定結果進行數據分析之后，構建產地模型，總體預測準確率93.75%，由此判定該模型是基本可靠，有待進一步擴大樣本量和在技術推廣中完善其后續的模型預測產地的精準度的完善與提高。