馬齒莧不同溶劑提取物的抗氧化活性

林寶妹，張帥，洪佳敏，邱珊蓮，張少平，鄭開斌*

福建省農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所（漳州 363005）

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為馬齒莧科馬齒莧屬的草本植物，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，常作為中藥用于利尿、解熱、止痙、抗菌、殺蟲等治療[1]。馬齒莧營養(yǎng)成分豐富，含有多種人體必需氨基酸、維生素及礦質(zhì)元素，營養(yǎng)價值高[2]。馬齒莧化學成分多樣，分離鑒定的馬齒莧化學成分主要有多糖、黃酮、萜類、生物堿、揮發(fā)油以及酸類物質(zhì)如有機酸、不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等多種藥理學功效[3]，成為國內(nèi)外學者的研究熱點。國內(nèi)外對馬齒莧活性成分的研究多數(shù)為多糖、黃酮、生物堿及不飽和脂肪酸，而對酚類成分研究較少，此外不同溶劑提取對馬齒莧抗氧化能力影響的研究也較為薄弱。姚秋萍等[4]采用水、60%乙醇、90%乙醇、丙酮和氯仿為溶劑提取馬齒莧活性成分，并測定各提取物對DPPH·、·OH和O2-·清除能力。與之相比，試驗采用水、70%甲醇、70%乙醇和70%丙酮等具有極性梯度的4種溶劑提取馬齒莧活性成分，并分析測定提取物中總多酚、總黃酮含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性，為馬齒莧抗氧化活性成分的提取與應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬齒莧（采自福建省農(nóng)業(yè)科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所試驗田）。

1, 1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+）、鄰二氮菲（美國Sigma公司）；標準品沒食子酸、蘆丁（純度＞98%，日本東京化成工業(yè)株式會社）；TPTZ（純度99%，上海麥克林生物技術(shù)有限公司）；抗壞血酸（VC）、氯化鐵、醋酸鈉、冰醋酸、無水乙醇、95%乙醇、雙氧水、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

紫外可見分光光度計（L5S型，上海儀電分析儀器有限公司）；超純水機（UPW-20N型，北京歷元電子儀器有限公司）；分析天平（BS 110 S型，德國Sartorius集團）；粉碎機（WBL 2521H型，佛山美的集團）；冷凍高速離心機（MIKRO-22 R，德國Hettich）；臺式冷凍恒溫振蕩儀（THZ-C-1，蘇州培英實驗設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取物制備

將采集的新鮮馬齒莧挑揀清洗除去泥沙與殘葉，于60 ℃熱風干燥箱中烘干至恒質(zhì)量。干燥馬齒莧于粉碎機中粉碎（28 000 r/min）40 s，過40目篩，備用；以水、70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮為提取溶劑，取適量馬齒莧粉末，按照料液比1︰30（g/mL），180 r/min，于28 ℃恒溫振蕩箱中提取1 h，獲得馬齒莧不同溶劑提取物，提取物于冷凍離心機中以6 000 r/min離心15 min，取上清液，待測。提取液質(zhì)量濃度以每毫升提取液所含的原材料質(zhì)量計，單位為mg/mL。

1.3.2 總多酚含量測定

參考Tohidi等[5]的方法，采用福林酚法。將馬齒莧不同溶劑提取物用超純水稀釋成10 mg/mL，取0.5 mL樣品于試管中，加入2.5 mL 0.1 mol/L Folin-Ciocalteu試劑和2 mL 75 g/L碳酸鈉溶液，搖勻，45 ℃水浴反應15 min，于765 nm處測吸光度。按照上述方法，以沒食子酸為標準品，以沒食子酸質(zhì)量濃度為x軸，吸光度為y軸繪制回歸曲線。不同溶劑提取物的總多酚含量以每克原材料含有的沒食子酸質(zhì)量計，單位為mg/g。

1.3.3 總黃酮含量測定

參考邱珊蓮等[6]的方法，采用亞硝酸鈉-氯化鋁反應體系。將馬齒莧不同溶劑提取物用超純水稀釋成10 mg/mL，取1 mL樣品液，加入0.5 mL 50 g/L亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min后加入0.5 mL 100 g/L硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min，加入4 mL 40 g/L氫氧化鈉溶液，加入水定容至10 mL，靜置15 min，于510 nm處測其吸光度。按照上述方法，以蘆丁為標準品，以蘆丁質(zhì)量濃度為x軸，吸光度為y軸繪制回歸曲線。不同溶劑提取物的總黃酮含量以每克原材料含有的蘆丁質(zhì)量計，單位為mg/g。

1.3.4 抗氧化能力評價

1.3.4.1 DPPH·清除能力

參照Tang等[7]的方法。分別取1 mL樣品于試管中，加1.0 mL 0.2 mmol/L DPPH·的無水乙醇溶液，搖勻后置于暗處反應30 min，于517 nm處測定吸光度A1；同時設置空白對照組A0（以超純水代替樣品）和樣品本底組A2（以無水乙醇代替DPPH·溶液），按式（1）計算DPPH·清除率。按照上述方法測定VC對DPPH·的清除率。

1.3.4.2 ABTS+清除能力

參照袁媛等[8]的方法，并稍作修改。配制ABTS+儲備液，7 mmol/L ABTS+與2.45 mmol/L過硫酸銨等體積混合，暗處靜置16 h。測定前，將ABTS+儲備液用乙醇稀釋，使其在734 nm處吸光度為0.70±0.05，為反應工作液。取0.1 mL樣品于試管中，加入3.8 mL ABTS+反應工作液，搖勻后置于暗處反應6 min，于734 nm處測定吸光度A1，同時設置空白對照組A0（以超純水代替樣品）和樣品本底組A2（以乙醇代替ABTS+反應工作液），按式（2）計算ABTS+清除率。按照上述方法測定VC對ABTS+的清除率。

1.3.4.3 ·OH清除能力

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定[6]。2 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液和0.5 mmol/L鄰二氮菲的70%乙醇溶液、0.5 mmol/L硫酸亞鐵、樣品各1 mL依次加入試管中，加入1 mL 0.1%過氧化氫溶液，于37 ℃水浴中反應1 h，反應結(jié)束后于510 nm處測定吸光度A1，以超純水代替樣品為損傷組A2、以超純水代替0.1%過氧化氫溶液和樣品為未損傷組A0，按式（3）計算·OH清除率。按照上述方法測定VC對·OH的清除率。

1.3.4.4 總抗氧化能力測定

參考曹珍珍等[9]的方法，采用FRAP法測定提取物總抗氧化能力。配制FRAP反應試劑，將pH 3.6 0.3 mmol/L醋酸緩沖液、10 mmol/L TPTZ溶液（40 mmol/L HCl配制）、20 mmol/L氯化鐵溶液按照體積比10︰1︰1混合，于37 ℃水浴保溫30 min待用。將0.2 mL樣品與6 mL FRAP試劑混勻，37 ℃水浴反應25 min，于593 nm處測定吸光度。以VC（抗壞血酸）水溶液為標準繪制標準曲線，結(jié)果以mg VC/g干質(zhì)量表示。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007進行回歸曲線的制作；采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

以質(zhì)量濃度0.010～0.080 mg/mL沒食子酸測得的吸光度建立回歸方程：y=10.697 x+0.014（R2=0.998 2）。沒食子酸在試驗所設質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系，如圖1（a）所示。

由圖1（b）可見，蘆丁質(zhì)量濃度在0.200～0.600 mg/mL內(nèi)，其質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，獲得回歸方程y=1.258x-0.021，R2=0.996 8，曲線擬合度好。

圖1 沒食子酸（a）和蘆丁（b）標準曲線

2.2 總多酚和總黃酮含量

由圖2可見，馬齒莧不同溶劑提取物總多酚含量在8.615～11.323 mg/g之間，各提取物總多酚含量從高到低依次為：70%丙酮提取物＞70%甲醇提取物＞70%乙醇提取物＞水提取物。70%乙醇提取物和水提取物的總多酚含量較為接近，分別為8.874±0.084 mg/g和8.615±0.038 mg/g。馬齒莧70%乙醇提取物總黃酮含量最高，為12.415±0.200 mg/g，稍高于70%甲醇提取物（12.237±0.651 mg/g）；水提取物總黃酮含量最低，為6.815±0.159 mg/g，約為70%乙醇提取物的1/2；70%丙酮提取物的總黃酮含量居于中等水平，為8.569±0.230 mg/g。

圖2 馬齒莧不同溶劑提取物總多酚和總黃酮含量

2.3 馬齒莧不同溶劑提取物抗氧化能力

2.3.1 DPPH·、ABTS+、·OH清除能力

由表1可知，在試驗的濃度范圍內(nèi)，馬齒莧不同溶劑提取物對DPPH·、ABTS+、·OH等3種自由基的清除作用隨著提取物質(zhì)量濃度的升高而增強，二者呈線性關(guān)系，R2＞0.97。對DPPH·、ABTS+、·OH的清除能力大小順序依次均為：70%丙酮提取物＞70%甲醇提取物＞70%乙醇提取物＞水提取物。其中水提取物在試驗所設最高質(zhì)量濃度30 mg·mL-1時，其對·OH的清除率為45.23%，未超過50%，因此未獲得其對·OH的EC50值。馬齒莧不同溶劑提取物清除自由基能力大小為DPPH·＞ABTS+＞·OH，即對DPPH·清除能力最強，對·OH清除能力最弱。但以上馬齒莧4種溶劑提取物對DPPH·、ABTS+、·OH的清除能力均小于抗壞血酸。

2.3.2 總抗氧化能力

由圖3可見，抗壞血酸的質(zhì)量濃度在0.100～0.800 mg/mL，其質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系，R2=0.999 4，曲線擬合度好，回歸方程為y=1.009x+0.036，即隨著抗壞血酸質(zhì)量濃度升高，F(xiàn)RAP抗氧化反應體系中的Fe3+不斷被還原為Fe2+，吸光度最高可達0.849。將各提取物反應后的吸光度代入回歸方程計算得對應的VC當量，結(jié)果如圖4所示。馬齒莧各溶劑提取物總抗氧化能力大小順序依次為：70%丙酮提取物＞70%乙醇提取物＞70%甲醇提取物＞水提取物。70%丙酮極性最小，F(xiàn)e2+還原量最多，總抗氧化能力最強。

表1 馬齒莧不同溶劑提取物自由基清除效果的比較

圖3 VC總抗氧化能力回歸曲線

圖4 馬齒莧不同溶劑提取物總抗氧化能力

2.4 抗氧化活性、總多酚和總黃酮含量的相關(guān)性

如表2所示，馬齒莧提取物總多酚含量與總抗氧化能力呈顯著性正相關(guān)（p＜0.05），隨著總多酚含量上升，總抗氧化能力增強，馬齒莧不同溶劑提取物的總多酚含量可在一定程度上反映總抗氧化能力的強弱；總多酚含量與DPPH·、ABTS+清除能力有一定的正相關(guān)性，與·OH清除能力間相關(guān)性較弱。總黃酮含量與各抗氧化能力的相關(guān)性均較小。由表3可知，4種抗氧化方法之間，DPPH·和ABTS+以及DPPH·和FRAP之間顯著相關(guān)（p＜0.05），其他抗氧化評價方法之間的相關(guān)性則較弱。

表2 抗氧化和總多酚、總黃酮含量的相關(guān)性

表3 抗氧化評價指標間的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

多酚類化合物是植物的次級代謝產(chǎn)物，具有較強的抗氧化活性，表現(xiàn)在清除自由基[10]、還原能力[11]、抗油脂氧化[12]等方面。在食品生產(chǎn)過程中，通常會添加合成的抗氧化劑如BHA、BHT、TBHQ等以延緩氧化進程，但是合成抗氧化劑具有潛在的毒性，加之消費者對于天然產(chǎn)品的偏愛，尋找合適的多酚類天然抗氧化劑替代合成抗氧化劑成為研究熱點[13]。通常采用水與甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑的混合液作為多酚的提取溶劑[14]，一方面利用有機溶劑的破壁能力，另一方面利用水提高提取溶劑的極性，達到有效提取目的。

采用DPPH·、ABTS+、·OH、FRAP抗氧化體系評價馬齒莧的水、70%甲醇、70%乙醇和70%丙酮提取物的抗氧化活性，并測定總多酚和總黃酮含量。結(jié)果表明，馬齒莧不同溶劑提取物在4種抗氧化評價體系中均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。各溶劑提取物在4種評價體系所得出的抗氧化能力的順序一致，依次為：70%丙酮提取物＞70%甲醇提取物＞70%乙醇提取物＞水提取物。說明70%丙酮能更有效地提取出馬齒莧中的抗氧化活性成分。各提取物對自由基的清除能力均為DPPH·＞ABTS+＞·OH，順序與VC一致，說明馬齒莧提取物中抗氧化活性成分與VC的抗氧化特性相似，對DPPH·的清除能力最強，對·OH的清除能力稍弱。在總抗氧化能力方面，70%丙酮提取物的VC當量可達137.405 mg VC·g-1，而周浩[2]檢測到馬齒莧中VC的含量僅為0.242 mg/g，說明馬齒莧中除了VC外，還有大量還原性物質(zhì)可發(fā)揮抗氧化作用。有機水溶劑提取物中的總多酚和總黃酮均較高，水提取物中二者含量均為最低，說明提取溶劑中含有部分有機溶劑能更好地提取總多酚和總黃酮，以70%丙酮提取物總多酚含量最高。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，總多酚與抗氧化活性間呈較強的正相關(guān)性，而總黃酮與抗氧化活性相關(guān)性較弱，可能是由于馬齒莧中發(fā)揮抗氧化活性的物質(zhì)除了黃酮外還有其他酚類成分。因此，可以選擇總多酚含量作為馬齒莧抗氧化提取物質(zhì)量評價的指標。同時，4種抗氧化評價結(jié)果之間并未呈相互相關(guān)，這可能是由于不同溶劑提取物中具有抗氧化活性的物質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、含量有所不同導致。另外，不同的抗氧化評價方法機理不同也對結(jié)果有一定影響[15]。因此，應采用多種不同抗氧化方法對天然提取物的抗氧化性進行綜合評價。

馬齒莧總多酚含量可作為抗氧化活性成分提取指標進行天然抗氧化劑的開發(fā)應用。有機水溶劑可作為馬齒莧抗氧化成分的提取溶劑，其中70%丙酮提取效果較佳，而有關(guān)馬齒莧抗氧化有效成分的化合物類型需要進一步試驗研究。