響應面法優化莜麥蛋白微波輔助堿法提取工藝

寧芯 ，班薇薇，王國澤，莫紫梅，汪磊 *

1. 玉林師范學院化學與食品科學學院（玉林 537000）；2. 廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室（玉林 537000）；3. 內蒙古科技大學生命科學與技術學院（包頭 014010）；4. 廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心（南寧 530001）

莜麥又稱裸燕麥，起源于我國，在我國高寒地區糧食生產中占有重要的地位[1]。莜麥是世界公認營養價值很高的糧種之一[2-3]，頗具保健療效[4-6]。隨著人們生活水平的提高和對營養概念的不斷認識，莜麥制品正日益受到人們的青睞，已被廣泛應用于食品、飼料、醫藥、化妝品和工業原料等領域[7-9]。莜麥中蛋白質高達11.4%～19.9%，居禾谷類作物之首[1,10-11]。莜麥蛋白質是谷物中氨基酸組成最平衡的蛋白質之一，其氨基酸含量多且種類齊全，配比合理，人體利用率高，其中人體的8種必需氨基酸是小麥的2倍多，且含有較多兒童發育不可缺少的組氨酸和賴氨酸[12]。經常攝入莜麥食品，可以有效改善我國傳統膳食引起的賴氨酸缺乏癥。因此，莜麥蛋白是優質的蛋白質資源，具有良好的開發前景。

傳統的蛋白質提取主要采用堿法提取，該方法雖然比較成熟，但需耗費大量堿液，所得的蛋白質純度不高，且提取率低，提取時間長，易造成蛋白質的水解和結構破壞[13-14]。微波輻射輔助提取法利用微波強化固液浸取過程，具有選擇性高、提取時間短、提取得率高以及不需要特殊的分離步驟等優點，是一種頗具發展潛力的提取技術[15]，近年來微波輔助提取法已被廣泛應用于多糖[16]、多酚[17]和蛋白[18-19]等成分的提取。

當前，常規堿法提取莜麥蛋白的研究較少，且采用微波輔助堿法提取莜麥蛋白的研究還鮮見報道。試驗研究莜麥蛋白的微波輔助減法提取工藝，在單因素基礎上，應用響應面法優化莜麥蛋白的提取工藝，以期為莜麥蛋白的提取和莜麥資源的加工利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、設備與儀器

莜麥（蒙燕7413），產于內蒙古武川縣。

石油醚（分析純，天津永大化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市華東試劑廠）；鹽酸（分析純，天津市振興化工試劑廠）；無水乙醇（分析純，天津市永天化學試劑有限公司）；牛血清蛋白（北京拜爾迪生物公司）；考馬斯亮藍（分析純，北京化學試劑公司）。

DFT-200 200克手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；JA5003電子分析天平（上海越平科技儀器有限公司）；L-550臺式低速大容量離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；PHS-3B型雷磁pH計（上海精密科學儀器有限公司）；WLS-l型微波爐（南京三樂微波研究所）；UV-7504單光束紫外-可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；KDN-08A定氮儀（上海昕瑞儀器儀表有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 莜麥蛋白的提取工藝

莜麥蛋白微波輔助堿提法：莜麥籽粒→磨粉→過篩→石油醚脫脂→脫脂莜麥粉→調漿→調pH→微波萃取→過濾→提取液→含量測定。

精確稱取5 g脫脂莜麥粉于三角瓶中，按一定料液比加入蒸餾水，并用1 mol/L的NaOH溶液調pH，在一定功率的微波下浸提一定時間，以3 500 r/min離心15 min，分離上清液，通過考馬斯亮藍法測定上清液中的蛋白質含量，計算微波輔助堿法提取莜麥蛋白提取率。

1.2.2 莜麥蛋白提取率的計算

采用凱氏定氮法測定脫脂莜麥粉中總蛋白的含量，通過考馬斯亮藍G-250染色法測定提取液中蛋白質含量[20]。

1.2.3 統計處理

所有數據應用Excel軟件、SPSS軟件和Design-Expert軟件進行處理和分析。其中，顯著性分析采用Duncan檢驗，p＞0.05判定為變化不顯著，p＜0.05判定為變化顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

以莜麥蛋白提取率為指標，分別研究微波功率（140，280，420，560和700 W）、pH（8，8.5，9，9.5，10和10.5）、料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（g/mL））、提取時間（0.5，1，1.5，2和2.5 h）對莜麥蛋白提取率的影響。試驗結果見表1，結果表明浸提液pH、微波功率、提取時間和料液比對莜麥蛋白提取率均有顯著性影響。顯著性分析結果表明在微波功率280 W、浸提pH 9.5、料液比1∶25（g/mL）、提取時間8.0 min的條件下，莜麥蛋白提取率最高。

圖1 單因素試驗結果

2.2 莜麥蛋白微波輔助堿提法工藝優化

在單因素試驗結果的基礎上根據Box-Behnken中心組合設計（BBD）的試驗原理選擇對莜麥蛋白提取率起主要影響的4個因素，以莜麥蛋白的提取率為考察指標進行四因素三水平的響應面分析試驗，使用Design-Expert軟件進行數據分析，求出數學模型，進而得到最佳的提取條件。莜麥蛋白微波輔助堿提試驗設計及結果見表1和表2。

利用Design-Expert軟件對表2的數據進行多元回歸擬合，得到莜麥蛋白提取率對微波功率（A）、pH（B）、料液比（C）和微波時間（D）的回歸方程：

表1 Box-Behnken方案設計的因素和水平編碼值表

表2 微波輔助堿法提取莜麥蛋白響應面試驗方案與試驗結果

對該回歸模型方差進行分析，具體結果見表3。由表3可知，模型p＜0.000 1，試驗所選用的模型具有高度的顯著性，失擬項p=0.262 8＞0.05，不顯著，決定系數R2=0.946 9，說明擬合程度良好，試驗誤差小，該模型可以用來預測莜麥蛋白的提取率，模型中C、B2、C2、D2極顯著，B、D顯著，其他項系數均不顯著。在所選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序為C＞D＞B＞A，即料液比＞微波時間＞pH＞微波功率。

表3 回歸方程的方差分析

圖2 兩因素交互作用對莜麥蛋白提取率的響應面圖和等高線圖

等高線是橢圓形則表示兩因素交互作用顯著，是圓形則表示交互作用不顯著，同時沿因素軸向等高線變化越密集，該因素對響應值影響越顯著，反之越弱。根據分析結果做出響應面曲面圖及等高線圖，結果如圖2所示。通過Design-Expert軟件得到微波輔助莜麥蛋白堿提的最佳參數為微波功率382 W、pH 9.45、料液比1∶22.8（g/mL）、提取時間7.75 min，預測值為79.51%。調整為微波功率380 W、pH 9.45、料液比1∶23（g/mL）、提取時間7.75 min，該條件下莜麥蛋白的提取率為79.24%，與理論預測值吻合，因此基于響應面法所得的優化提取參數準確可靠。

3 結論

應用響應面分析法優化莜麥蛋白微波輔助堿法提取工藝，結果表明微波輔助堿法提取莜麥蛋白的最佳工藝參數為：微波功率380 W、pH 9.45，料液比1∶23（g/mL）、提取時間7.75 min。此條件下莜麥蛋白的提取率為79.24%。影響莜麥蛋白微波輔助堿法提取提取率的因素次序為：料液比＞微波時間＞pH＞微波功率。與常規堿法提取莜麥蛋白相比（提取時間1.15 h，提取率62.02%），微波輔助提取法能大幅減小提取時間，顯著提高莜麥蛋白的提取率。