響應面法優化竹葉香豆素提取工藝

陳艷熙，賈春梅*

宜賓學院（宜賓 644000）

竹葉（Bamboo leaves）為禾本科植物淡竹的葉，中國具有豐富的竹葉資源，且香豆素是竹葉的主要功能活性物質之一，具有重要的醫學價值[1]，但國內外關于竹葉香豆素的研究非常少。提取香豆素主要方法有傳統溶劑法[2-4]、超聲波提取[5]、微波輔助提取[6]、超臨界流體萃取法[7-8]等。

此次試驗以毛竹葉為原料，在單因素試驗基礎上，進行四因素三水平的中心組合試驗，用軟件Design-Expert 8.0.1擬合響應值與影響因素的關系得到模型方程，分析模型方程得出提取竹葉香豆的素最佳工藝，將最優工藝進行驗證。優化竹葉香豆素的提取工藝可促進竹葉資源開發利用，為大規模提取竹葉香豆素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮毛竹葉（宜賓學院）；傘形花內酯（分析標準品，99%）；蘆?。ǚ治鰳藴势?，≥98%）；無水乙醇（分析純）；石油醚（分析純）。

TU-1901紫外分光光度計；800Y高速多功能粉碎機；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌機；R-100VN旋轉蒸發儀；722可見分光光度計。

1.2 香豆素定量分析方法

1.2.1 制備傘形花內酯標準溶液

精確稱取10 mg傘形花內酯，用40%乙醇定容于25 mL容量瓶。從中取5 mL加入一個50 mL容量瓶中，用40%乙醇定容，即得標準溶液（40 μg/mL）。

1.2.2 確定測定波長與參比波長

準備3只10 mL容量瓶，分別加入1.0，2.0和3.0 mL傘形花內酯標準溶液，用40%乙醇定容。在190～900 nm范圍內對溶液進行紫外可見光掃描，由圖譜可知傘形花內酯的特征吸收波長326 nm，所以選擇326 nm為香豆素類化合物的測定波長。

為消除提取液中黃酮類物質干擾，以蘆丁為標準品，配制不同濃度蘆丁溶液，對蘆丁溶液進行紫外可見光掃描，在掃描曲線上找一個與326 nm處吸收相等的波長383 nm，作為參比波長[18]。

1.2.3 繪制標準曲線

準備6只10 mL容量瓶，分別加入0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL傘形花內酯（40 μ g/mL）標準溶液，用40%乙醇定容。在選定雙波長處測定吸光度，將2個吸光度作差，將差值對傘形花內酯濃度線性回歸，得到標準曲線，線性回歸方程為：Y=0.133 8 X+0.062 3，R2=0.999 1。

1.3 制備樣品溶液

采摘宜賓學院新鮮竹葉，用清水洗凈，干燥，將干燥后的竹葉進行粉碎，過60目篩，以石油醚溶劑對竹葉進行脫色處理，脫色后的竹葉自然揮干，水浴烘30 min。準確稱取8.0 g竹葉，提取溶劑用70%乙醇，于60 ℃提取60 min，液料比30︰1（mL·g-1），提取2次，合并提取液并通過減壓旋蒸的方式將提取液中的乙醇旋出，制成浸膏，浸膏用40%乙醇定容至100 mL，得到樣品溶液。

1.4 計算樣品溶液中香豆素含量

取1 mL樣品溶液加入50 mL容量瓶中，用40%乙醇定容，采用雙波長法測定吸光度，記錄數據，根據線性回歸方程計算出樣品溶液中香豆素的含量。

1.5 日間精密度和日內精密度

準備3只50 mL容量瓶，分別加入1.0，1.5和2.0 mL樣品溶液，40%乙醇定容，采用雙波長法測定吸光度，記錄數據。測定日內精密度需要在同1 d內，每隔1.5 h測定1次數據，重復5次，測得1.0，1.5和2 mL樣品溶液中香豆素的RSD值分別為1.34%，0.874%和0.51%，表明日內精密度良好。測定日間精密度需要連續在5 d的同一時間測定吸光度，記錄數據，測得1.0，1.5和2 mL樣品溶液中香豆素的RSD值分別為4.42%，2.46%和0.817%，表明日間精密度良好。

1.6 回收率試驗

準備3只50 mL容量瓶，分別加入1.0，1.2和1.4 mL樣品溶液，1，3和5 mL傘形花內酯標準溶液，用40%乙醇定容，采用雙波長法測定吸光度，記錄數據，計算回收率，結果顯示，標樣的回收率分別為103.68%，99.86%和96.68%，回收率在95%～105%之間，回收率的RSD值小于5%，說明檢測系統對此試驗的測定結果影響較小，該分析方法可行。

1.7 單因素試驗

考察乙醇體積分數、提取溫度、提取時間、液料比對竹葉香豆素得率的影響。

1.8 響應面優化

綜合單因素的試驗結果，進行四因素三水平的中心組合試驗，用軟件Design-Expert 8.0.1擬合響應值與影響因素的關系得到模型方程，分析模型方程得出提取竹葉香豆素最佳工藝，將最佳工藝進行驗證。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 總香豆素得率隨乙醇體積分數的變化

由圖1可知，當乙醇體積分數較小時，香豆素在溶液中的溶解度較小，所以提取出的香豆素量很少。當乙醇體積分數為50%時，總香豆素得率達到最大值（1.362 mg/g）。隨乙醇體積分數繼續升高，竹葉中有更多的物質被提取出來，對測量結果會造成干擾。

圖1 總香豆素得率隨乙醇體積分數的變化

2.1.2 總香豆素得率隨液料比的變化

由圖2可知，當液料比較小時，溶液黏度過大，不利于物料運動，使得香豆素溶出率低。當液料比為25︰1（mL·g-1）時，總香豆素得率有最大值（1.379 mg/g）。液料比繼續增大，可能是由于溶液量過多，攪拌轉速不夠，造成物料在溶液中擴散速度較慢，所以香豆素提取率低。

圖2 總香豆素得率隨液料比的變化

2.1.3 總香豆素得率隨提取時間的變化

由圖3可知，提取40 min時，總香豆素得率有最大值（1.343 mg/g）。隨提取時間增加，由于竹葉中香豆素含量少，香豆素全部被提取出來后，隨著時間增長，被提取出來的黃酮濃度增大，計算香豆素得率時需要減去的值越大，所以香豆素得率在曲線上呈現出下降趨勢。

2.1.4 總香豆素得率隨提取溫度的變化

由圖4可知，在溫度較低時，分子熱運動較低，竹葉中香豆素溶出速率較慢。當提取溫度升高到70 ℃時，總香豆素得率達到最大值（1.683 mg/g），溫度繼續升高會破壞香豆素分子的結構，所以溶液中香豆素含量減少。

圖3 總香豆素得率隨提取時間的變化

圖4 總香豆素得率隨提取溫度的變化

2.2 響應面分析

2.2.1 試驗因素水平設計（參見表1）

表1 試驗因素水平表

2.2.2 建立模型及模型分析

以香豆素得率為因變量，A、B、C、D為自變量進行試驗設計，見表2。將4種影響因素和總香豆素得率進行擬合并建模分析。回歸方程（編碼）為：Y=1.50-0.051A+0.021B+0.089C+9.000×10-3D-0.055AB-0.019AD+0.12BC-0.15CD-0.25A2。

由表3可知，模型的p值=0.000 5＜0.05，說明模型有顯著性，有統計學意義；失擬項p值=0.479 5＞0.05，沒有顯著性，說明方程的擬合性好，可信度高。

由圖5可見，總香豆素得率隨提取時間增加而上升，隨乙醇體積分數增加，呈先升后降趨勢；由圖6可見，等高線圖為橢圓形，說明液料比與提取溫度交互影響非常顯著，提取條件變化對總香豆素得率影響較大。當提取溫度為65 ℃、液料比為27.5︰1（mL·g-1）時，總香豆素得率到達最大值；由圖7可見，總香豆素得率隨液料比升高而升高；隨乙醇體積分數升高則呈現先增后降趨勢；由圖8可見，提取時間和提取溫度間的交互對竹葉香豆素的提取率影響較大。

表2 試驗設計及結果

表3 模型方程方差分析

2.2.3 驗證最優工藝

對優化工藝（乙醇43.75%、提取溫度80 ℃、液料比20︰1（mL·g-1）、提取時間50 min）進行驗證，平行3次，最終總香豆素的平均得率為1.785 mg/g，與預測值1.870 mg/g的相對誤差為4.5%。

圖5 提取時間和乙醇體積分數對總香豆素得率的影響

圖6 液料比和提取溫度對總香豆素得率的影響

圖7 液料比和乙醇體積分數對總香豆素得率的影響

圖8 提取溫度和提取時間對總香豆素得率的影響

3 結論與討論

以毛竹葉為原料，在單因素試驗基礎上，采用多元二次回歸方程擬合響應值與影響因素之間的函數關系，得到模型方程：Y=1.50-0.051A+0.021B+0.089C+9.000×10-3D-0.055AB-0.019AD+0.12BC-0.15CD-0.25A2。通過建模分析，得出香豆素的最佳提取工藝：乙醇體積分數43.75%，提取溫度80 ℃，提取時間50 min，液料比20︰1（mL·g-1）。驗證試驗的總香豆素得率為1.785 mg/g，與預測值1.870 mg/g的相對誤差為4.54%，說明該模型擬合性較好，準確性較高，響應面法可用于優化竹葉香豆素提取工藝，且該方法簡單可行。與提取樣品溶液中香豆素含量0.868 mg/g比較，在此優化條件下進行提取，香豆素得率明顯提高，為大規模提取竹葉香豆素奠定基礎。試驗毛竹中香豆素得率為1.785 mg/g與謝捷等[2]研究的毛竹中香豆素含量6.19 mg/g相比，含量較低，可能是采摘竹葉季節和地域因素不同，造成這種差異。

試驗采用雙波長法測定吸光度，進行香豆素定量，具有操作簡單、快速的特點。但雙波長法的特異性較差，試驗樣品溶液為混合溶液，樣品溶液含有的其他物質會對測定結果造成干擾，所以在條件允許情況下，應采用更精確的方法進行試驗，提高特異性。