t-PA 基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)性在云南彝族人群中的分布

王 樂 ，范志祥，陳志彬，彭紅瑜，張延潔，張 璐，萬瑞雪，龍 莉

（1）昆明醫(yī)科大學細胞生物學和醫(yī)學遺傳學系，云南昆明 650500；2）昆明醫(yī)科大學第一附屬院生殖遺傳科，云南昆明 650031）

組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）是一種有527 個氨基酸[1]、3 條糖鏈組成的分子量為67KDa 的絲氨酸類蛋白水解酶，也是血管內纖維蛋白溶解系統(tǒng)的主要活化劑。其生理作用是促進血管內纖維蛋白溶解，從而防止血栓形成和生長。t-PA 在炎癥、損傷的愈合、癌癥的預后和轉移以及對其他疾病的易感性中起重要作用[2]。另外，t-PA 在人體中樞神經系統(tǒng)（CNS）的各種神經元中高度富集，包括新皮質，錐體神經元和海馬，因此參與中樞神經系統(tǒng)的一些生理和病理過程，如學習和記憶，焦慮，癲癇，中風，阿爾茨海默病和脊髓損傷[3]。t-PA 由染色體8p11.21 上的t-PA（纖溶酶原激活物組織類型）進行基因編碼，包含8 個外顯子。在t-PA 基因中發(fā)現的第一個多態(tài)位點是內含子8 中311bp Alu 序列的插入/缺失多態(tài)[4]。目前研究表明，t-PA 多態(tài)與中國漢族人群顳葉癲癇（temporallobeepilepsy，TLE）[5]、荷蘭人群心肌梗塞[6]、土耳其人群牙周炎[7-8]、克羅地亞等人群多發(fā)性硬化癥[9]、韓國人群十二指腸潰瘍相關[10]。目前為止，尚無有關彝族人群t-PA 基因Alu重復序列I/D 多態(tài)分布的報道，本研究應用PCR技術研究t-PA 基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)在云南昆明晉寧縣彝族健康人群t-PA 基因Alu 重復序列t-PA 基因Alu 重復序列中的分布情況。

1 資料與方法

1.1 研究對象

云南省昆明市晉寧縣雙河鄉(xiāng)彝族村民共275例，其中男88 例，女187 例，平均年齡（49.0±15.7）歲。均為該地區(qū)彝族，且所有對象對調查和檢測項目均知情并同意。通過病史、體檢、實驗室和心電圖等檢查排除冠心病、高血壓、心肌病、瓣膜性心臟病和先天性心臟病者。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA 提取用采血管取靜脈血2 mL，EDTA 抗凝，白細胞分離，低滲溶血，酚-氯仿有機抽提法提取基因組DNA，-80℃保存。

1.2.2 目的片段PCR 擴增特異性擴增包含t-PA基因Alu 重復序列I/ D 的DNA 片段，引物序列（上游引物5'-GCTGTTCTCCTGACATCTTTATTGC-3'）下游引物（5'-GTGGTGAAGGCACTTTATTATCTAAG-3'）。反應體系為10 μL 包括TaqDNA 聚合酶0.25 μL（北京擎科新業(yè)生物技術有限公司），模板DNA0.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddH2O 3.5 μL；反應條件：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸1min 進行35 個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min，4℃保存。

1.2.3 基因型鑒別取10 μL擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，以2 000 bp Marker 作對照，在UVP 凝膠成像儀上觀察結果。PCR 擴增產生1 211 bp 的插入片段和900 bp 的缺失片段。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 軟件進行數據分析。計算各組等位基因及基因型頻率，用Hardy-Weinberg 平衡檢驗確定研究樣本的群體代表性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢測

在275 名彝族對照受試者中，t-PA 基因Alu重復序列I/D 多態(tài)性相關基因型頻率和等位基因頻率及其預期值分布符合Hardy-Weinberg 平衡（X2＝0.2800，P＝0.600），具有群體代表性。

2.2 基因型鑒定

經PCR 擴增的產物用瓊脂糖電泳檢測發(fā)現有3 種基因型分別為:（1）t-PA-Alu-I I 基因型，是一條1 211 bp 片段；（2）t-PA-Alu-I D 基因型，是兩條片段分別為1 211 bp 和900 bp；（3）t-PA-Alu-D D 基因型，是一條900 bp 的片段，見圖1。

圖1 t-PA 基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)性的3 種基因型Fig.1 Three genotypes of t-PA Gene Alu-repeat I/D polymorphism

2.3 t-PA 基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)性在云南彝族人群中的分布

在云南省昆明市晉寧縣雙河鄉(xiāng)275 名彝族健康人群中，經鑒定，基因型分別為DD、ID 和II，各有75、133 和67 例。根據遺傳平衡定律可計算出相應基因型的頻率分別為27.3%、48.4%、24.3%，等位基因D 和I 的頻率分別為51.5%和48.5%。在88 名男性中，DD、ID 和II 基因型頻率分別為23.86%、54.56%、21.59%，等位基因D 和I 的頻率分別為51.14%、48.86%；而在187 名女性中，DD、ID 和II 基因型頻率分別為28.88%、45.46%、25.67%，等位基因D 和I 的頻率分別為51.6%、48.4%，見表1。男性和女性相比，t-PA 基因Alu重復序列I/D 多態(tài)性的基因型頻率無統(tǒng)計學意義（X2＝1.98，P＝0.371），基因頻率也無統(tǒng)計學意義（X2＝0.01，P＝0.918）。

表1 在彝族人群中t-PA 基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)性的分布［n（%）］Tab.1 The distribution of t-PA Gene Alu-repeat I/D polymorphism in Yi nationality population ［n（%）］

2.4 彝族t-PA 基因Alu 重復序列I/ D 多態(tài)性分布與其他種族比較

云南彝族人群與報道的巴基斯坦、印度、美國、韓國[11]、日本[2]人群相比較，基因型頻率和等位基因頻率均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與英國人群相比較，無論基因型頻率還是等位基因頻率均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

從基因型看，云南彝族人群II 基因型頻率為24.36%，低于巴基斯坦人群30.88%、日本人群30%、美國人群29.27%、印度29.39%、韓國20%均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；低于英國人群33.71%并有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。云南彝族人群ID 基因型頻率為48.36%，低于日本人群50%、英國人群48.95%、美國人群49.59%、高于巴基斯坦人群45.16%印度人群48.20%、韓國人群47.03%均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。云南彝族人群DD 基因型頻率為27.27%，高于巴基斯坦人群23.96%、印度人群22.41%、日本人群20%、美國人群21.14%；低于韓國人群32.97%均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；高于英國人群17.33%并有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

從等位基因看，云南彝族I 等位基因頻率為48.55%，低于美國人群54.07%、巴基斯坦人群53.45%、印度人群53.49%、韓國人群43.51%、日本人群55%均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；低于英國人群58.19%并有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。云南彝族人群D 等位基因頻率為51.45%，高于美國人群45.93%、巴基斯坦人群46.54%、印度人群46.51%、韓國人群56.49%、日本人群45%均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；高于英國人群41.81%并有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。綜上所述，t-PA 基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)性分布在不同民族之間差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 不同人群t-PA 基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)性基因型頻率和等位基因頻率［n（%）］Tab.2 Comparisons of genotype frequency and gene frequency of t-PA Gene Alu-repeat I/D polymorphism between Yi nationality and other populations ［n（%）］

3 討論

在t-PA 基因中發(fā)現的第一個多態(tài)是內含子8中311bp Alu 重復序列的插入/ 缺失多態(tài)性（rs4646972）。Alu 序列的擴增多態(tài)性作為人種分型重要依據之一。隨著后基因組計劃的開展，發(fā)現Alu 重復序列的插入或缺失可能還存在某種功能性影響，例如可能改變mRNA 的轉錄穩(wěn)定性，或者影響Alu 序列下游內含子的剪接[11-12]。現在已經發(fā)現t-PA 基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)性在心血管疾病[13]、癲癇[5]、多發(fā)性硬化癥[9]、十二指腸潰瘍[10]、腦栓塞[12]、牙周炎[7]等多種疾病中起著重要的作用。由于不同種族的遺傳背景、生活習性、環(huán)境因素各不相同從而導致了不同種族對某些疾病的易感性不同。據報道，Alu 重復多態(tài)性與荷蘭受試者急性心肌梗死的發(fā)生率增加有關[14]，但在北美[15]或英國[16]的研究中則無關。間接說明了Alu 重復多態(tài)性可能與種族差異有關。

現有報道表明彝族與其他民族和種族之間存在遺傳差異，例如云南彝族的ACE 基因G2350A、AT1R 基因A1166C、AGT 基因M235T、MCP-1 基因G-2518A、CX3CR1 基因T280M、CYP4A11 基因rs9333025 A/G 等位點的基因頻率和基因型頻率與一些種族或民族均有顯著差異[17-23]。本研究顯示云南彝族人群t-PA 基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)性與英國人群相比較，無論基因型分布還是基因頻率均差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這一結果與前面報道的研究結果一致。

綜上所述，t-PA 基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)在心血管疾病、癲癇、多發(fā)性硬化癥、十二指腸潰瘍、腦栓塞、牙周炎等多種疾病中起著重要的作用，本研究旨在云南彝族t-PA 基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)性與其他種族進行比較，為探究t-PA基因Alu 重復序列I/D 多態(tài)性與其他疾病的關系奠定基礎。