神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫放射分析藥盒的優(yōu)化

魏冰雪

（北京北方生物技術(shù)研究所有限公司，北京 100076）

1 研究背景

目前NSE被認(rèn)為是腦損傷和非小細(xì)胞肺癌的一項(xiàng)高特異性和敏感性的生化指標(biāo)，對(duì)小細(xì)胞肺癌患者和顱腦損傷病人的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)、療價(jià)評(píng)價(jià)有重要價(jià)值[1-2]。

2 材料和方法

2.1 主要儀器與試劑 伽馬計(jì)數(shù)器為西安核儀器廠產(chǎn)品；NSE抗原（購(gòu)自HYTEST公司）、標(biāo)記NSE單抗（購(gòu)自Medix Biochemica公司）、包被NSE單抗（來(lái)自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司）、放射性Na125I溶液（購(gòu)自PE公司）、新生牛血清（購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司）、法國(guó)CISBIO公司NSE免疫放射分析藥盒。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制 用100%新生牛血清將NSE抗原配制成0、5、25、50、100、200 ng/mL，4 ℃保存。

2.2.2 NSE抗體包被管制備 用pH=7.4 PBS配制含有一定濃度的NSE單抗包被液，向每管六角花試管中加入250 μL包被液，室溫過夜，抽干，再加入0.5 mL封閉液（5%蔗糖，0.1%NaN3，pH=7.4 PBS），室溫放置4 h，抽干封閉液，真空干燥，4 ℃保存。

2.2.3125I-NSE標(biāo)記物制備 用50 μL 0.05 M PB溶解50 μg NSE單抗，加入4.5 mCi Na125I 溶液，搖勻，加入10 μL 2.0 mg/mL氯胺-T溶液，搖勻，反應(yīng)1 min，再加入10 μL 4.0 mg/mL偏重亞硫酸鈉，搖勻，反應(yīng)1 min，終止反應(yīng)，用G50分離柱分離，檢驗(yàn)合格后分裝，分裝時(shí)保證每200 μL125I-NSE標(biāo)記物每分鐘放射性計(jì)數(shù)（CPM）為320000左右，4 ℃保存。

2.2.4 放免分析程序與數(shù)據(jù)處理方法 取50 μL NSE標(biāo)準(zhǔn)品或樣品加入NSE抗體包被管中，加入200 μL125I-NSE標(biāo)記物，37 ℃水浴3 h，反應(yīng)平衡后吸棄反應(yīng)液（除總T管），每管加入2 mL蒸餾水洗滌4次，吸凈試管中的液體，在γ計(jì)數(shù)器上測(cè)定各管的1 min放射性計(jì)數(shù)。采用以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以CPM值為縱坐標(biāo)，以Log-log直線回歸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后計(jì)算出樣品中NSE的含量。

3 結(jié)果

3.1 NSE抗體包被濃度的選擇 將NSE抗體配制成1.5 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL三個(gè)濃度，按 250 μL/管包被，做標(biāo)準(zhǔn)品的零點(diǎn)及首末點(diǎn)。結(jié)果表明：當(dāng)NSE抗體濃度達(dá)到2 μg/mL時(shí)，B0/T%、B1/B0%、B5/B0%分別為0.24%、2.24%和77.13%，比例恰當(dāng)，最終選擇NSE抗體包被濃度為2 μg/mL。

3.2 反應(yīng)時(shí)間的選擇 選擇1、2、3 和4 h四個(gè)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行室溫震蕩，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)品與臨床樣本，結(jié)果見表1。結(jié)果表明: 當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，B0/T%、B1/B0%、B5/B0%達(dá)到平衡點(diǎn)，且樣品的測(cè)值穩(wěn)定，最終選擇反應(yīng)時(shí)間為3 h，即反應(yīng)條件為室溫震蕩3 h。

表1 反應(yīng)時(shí)間的選擇

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 通過方法學(xué)建立，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)量范圍為5-200 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.9652X+2.7887，r2=0.9999。

3.4 靈敏度 同時(shí)測(cè)定20個(gè)“零”標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)數(shù)，計(jì)算均值x和標(biāo)準(zhǔn)差s，求出x+2s值，并將此值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出對(duì)應(yīng)的濃度為0.5 ng/mL，即為此方法學(xué)的靈敏度。

3.5 系統(tǒng)比對(duì) 改進(jìn)后藥盒與法國(guó)CISBIO公司NSE藥盒同時(shí)測(cè)量50份血清樣品，并對(duì)測(cè)得的NSE值進(jìn)行比較。結(jié)果表明，本方法與CISBIO公司NSE藥盒的相關(guān)性方程為Y=0.9681X+0.7939，相關(guān)系數(shù)r2=0.974。

3.6 穩(wěn)定性 使用37 ℃保存3 d、4 ℃保存3 d的藥盒、新制備藥盒，同時(shí)測(cè)試10份濃度不同樣本，使用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＞0.05表示測(cè)值無(wú)顯著差異。

4 討論

改進(jìn)后藥盒，檢測(cè)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，靈敏度為0.5 ng/mL，熱穩(wěn)定性良好，與法國(guó)CISBIO公司NSE藥盒同時(shí)測(cè)定50份樣本，結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r2為0.974。