植物細胞分裂素orthoTopolin Riboside對人白血病細胞株THP1的抗癌活性及機制初探

(大連理工大學生命與醫藥學院,遼寧盤錦 124221)

白血病是一類造血干細胞異常引起的克隆性惡性疾病,由于克隆中的白血病細胞失去進一步分化成熟的能力而停滯在骨髓、外周血和其他造血組織中大量增生積聚,并浸潤其他器官及組織,而使正常造血系統受到抑制[1]。急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是成年人中最常見的白血病類型之一,約占成人急性白血病的80%左右。該病具有起病急,病情發展迅速,發病率隨著年齡的增加而增加的特點[2]。目前傳統的治療仍以化療為主,但仍存在各種并發癥以及化療藥物的骨髓抑制,神經毒性等副作用[3-4]。因此,尋找有效提高治療效率,毒副作用小的藥物來治療AML仍然十分必要。

細胞分裂素(cytokinin)是20世紀50年代被發現的一類植物激素。天然存在的細胞分裂素是腺嘌呤衍生物,由其嘌呤N6位置上的H被其它基團取代而形成,存在形式包括:堿基、腺苷、腺苷-5-磷酸、3-,7-,9-,O-糖苷和氨基結合物等,活性因側鏈的長度、不飽和度不同而有很大差異。細胞分裂素在植物的生長發育中起著重要的調節作用,如:促進芽的形成與生長,延緩葉片衰老,促進芽的形成與生長,調節植物頂端優勢等[5-6]。以往對細胞分裂素的研究主要集中在調節植物的生長發育中,其藥用價值卻一直被忽略。近年來,腺苷類細胞分裂素表現出的抗腫瘤活性逐漸引起了腺苷類藥物研發工作者的注意。如N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine可通過抑制TNF-α誘導的NF-κB報告基因的表達來抑制宮頸癌HeLa細胞的增殖[7];Kinetinriboside通過周期阻滯抑制直腸癌HCT-15細胞和黑色素瘤的增殖[8-9],在靶向誘導急性髓性白血病干細胞的凋亡的同時對正常造血干細胞沒有損傷[10],可通過調控Bcl-2家族蛋白和caspase凋亡蛋白等誘導宮頸癌HeLa細胞的凋亡[11];N6-benzyladenosin可通過抑制周期蛋白依賴激酶2(CDK2)抑制多種腫瘤細胞的增殖[12];N6-isopentenyladenosine可通過上調NK細胞活化性受體NKG2D和周期阻滯抑制神經膠質瘤細胞的增殖[13],可通過影響Akt/NF-κB通路抑制人乳腺癌MDAMB-231細胞和人宮頸癌HeLa細胞的增殖和凋亡[14-15]等。以上報道表明腺苷類細胞分裂素具有潛在的抗腫瘤藥用價值,但其作用機制仍處于初步研究階段。因此進一步探究其分子作用機制對新型腺苷類藥物的開發具有重要的現實意義和理論價值。

oTR是楊柳科健楊樹葉受光照影響合成的一種腺苷類細胞分裂素(圖1)[16-17],在目前已知天然腺苷類細胞分裂素中,oTR對人的9大瘤系60種腫瘤細胞系(NCI60)顯示出最強的體外增殖抑制活性,且在抗腫瘤藥物高通量體內篩選模型-中空纖維模型中,oTR對NCI60中的12種腫瘤細胞均無急性毒性反應[18],以上結果提示oTR具有巨大的抗腫瘤藥物研發價值。然而迄今為止,oTR對AML的研究尚未見報道。

圖1 oTR化學結構式Fig.1 Chemical structure of oTR

本研究以人白血病細胞株THP-1為研究對象,初步探討oTR對THP-1細胞的抗腫瘤活性及作用機制,為天然植物來源的核苷類藥物的研發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

THP-1細胞株 北京協和細胞庫;胎牛血清、青霉素/鏈霉素、CCK-8細胞活性檢測試劑盒 上海生工生物工程有限公司;RPMI 1640細胞培養基 美國Gibco公司;細胞凋亡染色試劑盒、瑞氏吉姆薩染液 碧云天生物技術公司;N6-2-芐胺羥基腺苷(ortho-Topolin Riboside,oTR) 青島騰龍微波科技有限公司;阿糖胞苷Ara-C、CD11b-PE熒光抗體 美國BioLegend公司;腺苷A1受體拮抗劑DPCPX、腺苷A2A受體拮抗劑SCH58261、腺苷A2B受體拮抗劑MRS1754、腺苷A3受體拮抗劑MRS1191、核苷轉運體拮抗劑 Dipyridamole Sigma公司。

Thermo 371二氧化碳培養箱、3001酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司;L2-4K臺式低速離心機 湖南可成儀器設備有限公司;DMI 4000B萊卡倒置熒光顯微鏡 德國Leica公司;FACSCalibur流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 106個THP-1細胞浮于含有10%滅活胎牛血清,含青霉素100 kU/L,鏈霉素100 mg/L的無菌RPMI 1640培養液中,置于懸浮細胞培養瓶中,在37 ℃,5%CO2及飽和濕度下的培養箱中培養,細胞長至70%～80%左右傳代1次。

1.2.2 藥物配制 0.3、1.5、15和30 μmol/L的陽性對照藥物Ara-C用1640培養基溶解,相同濃度的oTR用0.1% DMSO助溶后用培養基稀釋到所需濃度,過濾除菌,室溫保存備用。DPCPX、SCH58261、MRS1754、MRS1191和Dipyridamole用0.1% DMSO溶解,使終濃度達到10 μmol/L,室溫保存。

1.2.3 通過CCK-8法和形態學觀察oTR對THP-1細胞的增殖抑制作用 接種104個/孔THP-1細胞于96孔板,每孔0.1 mL,實驗設置對照組、0.1% DMSO組以及不同濃度的Ara-C或oTR處理組,每組各4個復孔,藥物終濃度分別為0.3、1.5、15、30 μmol/L。藥物作用48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液作用2 h,用酶標儀在波長490 nm處讀取光密度值(OD值),計算不同濃度Ara-C或oTR對細胞的增殖抑制率[19]。并選擇接近IC50值的oTR濃度(0.3和1.5 μmol/L)作用細胞,通過光學顯微鏡觀察細胞的形態變化。

1.2.4 通過細胞計數板觀察oTR對細胞增殖數目的影響 接種104個/孔THP-1細胞于96孔板,每孔0.1 mL,實驗設置對照組、0.1% DMSO組以及不同濃度的oTR處理組,每組各4個復孔,藥物終濃度分別為0.3、1.5 μmol/L。藥物作用48 h后用血細胞計數板計數。

1.2.5 通過核苷轉運體拮抗劑觀察oTR進入細胞的途徑 接種104個/孔THP-1細胞于96孔板,每孔0.1 mL,用核苷轉運體拮抗劑(10 μmol/L Dipyridamole)孵育2 h后,加入1.5 μmol/L oTR及0.1% DMSO對照組,作用48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液作用2 h,用酶標儀在波長490 nm處讀取光密度值(OD值),通過細胞增殖活性結果觀察上述拮抗劑是否對oTR引起的細胞增殖抑制有逆轉作用,如果可逆轉說明oTR通過核苷轉運體進入細胞。

1.2.6 通過腺苷受體拮抗劑觀察oTR進入細胞的途徑 接種104個/孔THP-1細胞于96孔板,每孔0.1 mL,分別用10 μmol/L腺苷受體拮抗劑(A1受體拮抗劑DPCPX、A2A受體拮抗劑SCH58261、A2B受體拮抗劑MRS1754、A3受體拮抗劑MRS1191)孵育2 h后,加入1.5 μmol/L oTR及0.1% DMSO對照組作用48 h,檢測方法同后1.2.4。如果可逆轉說明oTR通過腺苷受體進入細胞。

1.2.7 PI染色法檢測oTR對THP-1細胞亞倍體凋亡峰的影響 將106個/孔THP-1細胞密度接種至六孔板中,選擇接近IC50值的oTR濃度(0.3、1.5 μmol/L)作用細胞,48 h后收集未加藥對照組和藥物處理組細胞,PBS緩沖液洗一遍,用70%乙醇固定過夜后再用PBS洗一次,按DNA含量檢測試劑盒配制染色緩沖液,將上述所收集的細胞加入500 μL染色緩沖液37 ℃避光孵育30 min,用PBS洗一次后用300目篩網過濾后上流式細胞儀檢測[20]。

1.2.8 Wright-Giemsa(瑞氏吉姆薩)染色觀察oTR對THP-1細胞分化狀態的影響 將106個/孔THP-1細胞密度接種至6孔板中,選擇作用后細胞形態較為完整的1.5 μmol/L oTR處理THP-1細胞,48 h后收集細胞,PBS緩沖液洗一遍并重懸,將重懸細胞液通過臺式低速離心機甩板機以2000 r/min離心10 min,以便將細胞均勻固定在干凈的載玻片上,將載玻片從甩板離心機中取出并室溫晾干,滴加Wright-Giemsa染液于載玻片上,室溫染色1～2 min滴加等量的0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液,輕輕晃動玻片,與瑞氏-姬姆薩染液充分混勻,室溫染色15 min,顯微鏡下觀察細胞質和細胞核形態變化[21]。

1.2.9 通過細胞表面分化抗原CD11b檢測oTR對THP-1細胞分化能力的影響 將106個/孔THP-1細胞密度接種至6孔板中,選擇作用后細胞形態較為完整的1.5 μmol/L oTR處理THP-1細胞,48 h后收集細胞,PBS緩沖液洗一遍并重懸。向對照組和oTR處理組加入封閉抗體,用渦旋器輕輕震蕩混合均勻,室溫條件下,孵育15 min后分別向兩組細胞中加入2 μL CD11b-PE熒光抗體,用渦旋器輕輕震蕩混合均勻,室溫條件下,避光孵育30 min[21]。用1×PBS緩沖液洗滌染色細胞1次,去除多余的熒光試劑,減少上機背景雜質,加500 μL 1×PBS重懸細胞后流式細胞分選儀上機檢測細胞表面CD11b分化抗原表達量的變化。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次,實驗數據以平均值±SD形式表示,顯著性差異分析用SPSS 11.5軟件進行。*P<0.05為顯著,**P<0.01為極顯著。

2 結果與分析

2.1 oTR和Ara-C對THP-1細胞活性的抑制作用

分別用不同濃度(0.3、1.5、15和30 μmol/L)Ara-C或oTR處理THP-1細胞,發現相同濃度下,oTR作用后,細胞活性受到顯著性抑制(P<0.01或P<0.001),抑制強度比Ara-C更高(圖2),以上結果表明oTR比陽性對照物Ara-C具有更強的細胞活性抑制作用。

圖2 相同濃度下oTR和陽性對照藥物Ara-C對THP-1細胞增殖活性的抑制作用Fig.2 Inhibition of proliferation effects on THP-1 cells ofoTR and positive control drug Ara-C at the same concentration注:“*”表示與對照組相比,差異顯著,P<0.05,“**差異極顯著,P<0.01,“***”表示差異極其顯著,P<0.001;圖4～圖5同。

2.2 形態學觀察oTR對THP-1細胞形態的影響

選取接近IC50值的oTR濃度(0.3和1.5 μmol/L)作用細胞后,通過光學顯微鏡對細胞形態觀察發現,與對照組相比,oTR處理后引起細胞形態發生明顯改變,細胞體積變小,大小不均一,細胞膜皺縮,折光性減弱(圖3),以上結果表明oTR可誘導THP-1細胞的凋亡或壞死。

圖3 光學顯微鏡觀察不同濃度oTR處理THP-1細胞48 h后的形態變化Fig.3 Changes in cell morphology after incubation with of oTR for 48 h

2.3 細胞計數觀察oTR對THP-1細胞的增殖抑制作用

用不同濃度梯度的oTR作用細胞不同時間后,通過細胞計數板計數發現與對照組相比,oTR處理組的細胞數目明顯減少(圖4),以上結果表明oTR抑制THP-1細胞的增殖。

圖4 不同濃度oTR處理THP-1細胞不同天數后的細胞數目變化Fig.4 Cell number of THP-1 cells treatedby different concentrations of oTR

2.4 腺苷受體拮抗劑和核苷轉運體拮抗劑對oTR引起的THP-1細胞活性抑制的逆轉作用

目前核苷轉運體主要有兩類,即平衡型核苷轉運體(equilibrative nucleoside transporter,ENT)和濃度型核苷轉運體(concentrative nucleoside transporter,CNT),ENT介導核酸的順濃度差的易化擴散,速度快。而CNT消耗能量ATP,介導主動轉運過程,速度較慢。腺苷受體屬于G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors,GPCRs))超家族,廣泛分布于人體組織中[22]。腺苷受體是重要的藥物靶標近年來,越來越多的腺苷受體拮抗劑被相繼報道,但大部分腺苷受體拮抗劑顯示出選擇性差的特點[23]。因此,在開發新的抗腫瘤藥物中需要對其跨膜轉運機制有充分的認識,可為提高藥物的抗癌效果和研究癌細胞耐藥機制提供一定的基礎。本實驗用4種腺苷受體拮抗劑(DPCPX、SCH58261、MRS1754、MRS1191)和核苷轉運體拮抗劑(Dipyridamole)分別預孵育THP-1細胞2 h后,用1.5 μmol/L oTR繼續作用THP-1細胞,觀察拮抗劑是否逆轉oTR對細胞的增殖抑制作用。結果發現,與oTR單獨作用相比,4種腺苷受體拮抗劑作用效果無顯著差異(圖5A),但核苷轉運體拮抗劑Dipyridamole可明顯逆轉THP-1細胞的增殖抑制作用(圖5B)。以上結果表明,oTR通過核苷轉運體途徑進入細胞而不是腺苷受體途徑。

圖5 腺苷受體拮抗劑(A)與核苷轉運體拮抗劑(B)對oTR作用細胞后的逆轉效果Fig.5 Reversal effect treated by the presence of adenosinereceptor antagonists(A)and nucleoside transporter antagonist(B)

2.5 oTR對THP-1細胞的凋亡誘導作用

細胞死亡有毒性和凋亡兩種情況。當細胞發生凋亡時,由于胞漿和染色質濃縮,核裂解,產生凋亡小體,使細胞的光散射性質發生變化。因此可通過流式細胞儀測定細胞光散射的變化來觀察凋亡細胞[24]。用PI對細胞進行染色后,凋亡細胞由于總DNA量降低,于正常G0/G1細胞群前出現DNA低染細胞群,即G1峰前出現亞二倍體峰(sub-G1),即細胞凋亡群。分別用0.3和1.5 μmol/L oTR處理THP-1細胞48 h后,用PI染色流式細胞儀檢測發現,與對照組(1.21%)相比,oTR處理組(3.7%和19.23%)THP-1細胞出現明顯的亞二倍體峰(圖6)。以上結果表明oTR可誘導THP-1細胞發生凋亡。

圖6 oTR對THP-1細胞的凋亡誘導作用Fig.6 Effects of apoptosis ofTHP-1 treated by oTR

2.6 oTR對導THP-1細胞的分化誘導作用

選擇作用后細胞形態較為完整的1.5 μmol/L oTR處理THP-1細胞48 h后進行瑞氏-吉姆薩染色,發現與對照組相比較,oTR處理組細胞核質比減小,細胞核呈腎形或馬蹄狀(圖7)。CD11b是細胞粘附分子整合素家族成員之一[25],成熟的單核細胞、NK細胞、巨噬細胞和所有的粒細胞的細胞表面都有表達CD11b,不同成熟階段的髓細胞表達CD11b的量有所差別[26]。如:骨髓中的早幼粒細胞、中幼粒細胞、晚幼粒細胞和外周血中的成熟粒細胞通常可通過CD11b陽性程度來區別,越成熟的細胞,表達CD11b的量越多,CD11b陽性率也越高。一般情況下,髓系白血病細胞均表達CD11b,但表達CD11b的量有所差異,分化程度越低的白血病細胞表達CD11b的量越低,因此,可以用CD11b來表示白血病細胞的分化程度[27]。通過用流式細胞分析儀分析發現,相對于對照組,oTR處理組細胞表面CD11b相對表達量顯著增高(圖8),以上結果提示oTR能夠促進THP-1細胞分化更為成熟的粒細胞。

圖7 瑞氏-吉姆薩染色觀察oTR對THP-1細胞的誘導分化作用Fig.7 Morphological changes when cellstreatedwith oTR after staining with Wright-Giemsa

圖8 oTR對THP-1細胞表面CD11b表達的影響Fig.8 Effects of oTR on the expression ofCD11b in THP-1 cells

3 結論

本研究以尋找天然抗癌藥物為出發點,研究oTR對人急性髓性白血病細胞株THP-1的抗腫瘤活性及其跨膜進入細胞的方式。研究結果表明,用oTR處理THP-1細胞后細胞增殖活性明顯受到抑制,且相同濃度的oTR比陽性對照藥物Ara-C抑制效果更明顯。用oTR誘導THP-1細胞發現細胞亞二倍體峰比例明顯升高,說明oTR可誘導THP-1細胞的凋亡,且oTR處理后細胞表面CD11b相對表達量明顯增高,以上結果提示oTR能夠促進THP-1細胞的髓系分化。在研究oTR進入細胞的途徑方面,本研究初步以核苷轉運體(濃度依賴型)和腺苷受體家族為研究對象,發現封閉腺苷受體家族后并沒有逆轉oTR對THP-1細胞的增值抑制作用;然而封閉核苷轉運體后,可以部分恢復THP-1的細胞活性。以上結果表明,oTR通過核苷轉運體途徑進入細胞而不是腺苷受體途徑。本研究結果有望為新型腺苷類抗腫瘤藥物提供理論基礎和實驗依據。