菠蘿皮渣羧甲基纖維素/海藻酸鈉復合水凝膠珠固定化菠蘿蛋白酶的制備及穩定性研究

陳 輝,黃惠華

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510000)

菠蘿蛋白酶(bromelain)是從菠蘿中提取的一種由多種酶組成的混合物,在肉類嫩化、消炎、抗水腫等方面都有很廣泛的用途[1]。但菠蘿蛋白酶作為生物活性物質發揮作用時很容易受外界環境影響而失去活性[2-3]。與游離酶相比,固定化酶具有穩定性好、易回收、可重復利用等優點[4]。Jafary等[5]以戊二醛為交聯劑,將乳糖過氧化物酶固定在聚苯胺聚合物上,乳糖過氧化物酶的穩定性得到明顯提高,且能重復使用。Selvam等[6]制備了一種磁性納米顆粒并用于固定化細菌纖維素酶,發現固定化后的纖維素酶表現出更好的穩定性和活性。

海藻酸鈉(Sodium alginate,SA)是一種主要從褐藻中提取的酸性多糖,具有高粘度、良好的生物相溶性、可降解性以及在凝膠中能夠包覆其他材料的能力[7],是一種良好的固定化酶載體。菠蘿在加工過程中,會產生大量的副產物菠蘿皮渣,如果不加以利用直接丟棄,會造成資源的浪費和環境污染。然而,由于纖維素在大多數溶劑中的不溶性,將纖維素改性的應用更加廣泛。其中,通過纖維素的羧甲基化可以得到具有良好溶解性,生物相容性和生物降解性的羧甲基纖維素,其廣泛用于農業、穩定劑、緩凝劑和藥物中[8-10]。通過將菠蘿皮渣羧甲基纖維素(Pineapple peel residue carboxymethyl cellulose,PCMC)與SA共混制備水凝膠珠,并以此為載體固定化菠蘿蛋白酶,不僅能提高菠蘿蛋白酶的穩定性,還能提高酶的重復利用率,降低生產成本。

本實驗在前人[11]的基礎上,以生物相溶性良好的PCMC和SA為原料,共混制備復合水凝膠珠,并用于固定化菠蘿蛋白酶,以期為固定化酶載體的開發提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿皮渣纖維素(Pineapple peel residue cellulose,PPC) 實驗室自制[12];菠蘿蛋白酶(300 U/mg,CAS:8002-43-5)、海藻酸鈉 天津市科密歐化學試劑有限公司;其他試劑 均為化學純或分析純。

BSA12S-CW型精密分析天平 賽多利斯儀器有限公司;UV-1800紫外/可見分光光度計 日本島津公司;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 廣州市星爍儀器有限公司;JW-30260 minR型高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCMC的制備 參考He等[13]的方法并稍作修改:稱取2.0 g PPC加入到30 mL 95%乙醇中,攪拌使其充分混合。再向體系中加入3.0 mL 30%氫氧化鈉溶液,30 ℃條件下磁力攪拌1.5 h完成堿化反應。然后向其中加入2.4 g氯乙酸鈉,升溫到65 ℃反應2.0 h,完成醚化反應。用少量乙酸中和至pH為7～8,過濾后用50%乙醇溶液反復洗滌,50 ℃干燥,得到PCMC成品。

1.2.2 固定化菠蘿蛋白酶的制備 參考羅蘇芹等[14]的方法并稍作修改。分別稱取一定量的PCMC和SA于10 mL蒸餾水中,60 ℃磁力攪拌充分溶解后,冷卻至室溫。加入5.0 mL一定濃度的菠蘿蛋白酶溶液,繼續磁力攪拌混合均勻。將混合物用注射器緩慢滴到一定濃度的CaCl2溶液中交聯1.0 h形成水凝膠珠。然后將水凝膠珠浸泡在戊二醛溶液中進一步交聯一定時間,交聯完成后用去離子水反復清洗,除去未反應的雜質,用濾紙擦凈表面水分,得到固定化菠蘿蛋白酶,4 ℃貯存備用。

1.2.3 菠蘿蛋白酶的活力測定 游離菠蘿蛋白酶活性的測定[15]:取1.0 mL酶液,置于37.2 ℃水浴中預熱10 min,加入濃度為2.0 mg/mL酪蛋白溶液2.0 mL,混合搖勻后準確反應10 min。加入濃度為10%三氯乙酸溶液3.0 mL終止反應。保溫20 min后將混合物在8000 r/min下離心10 min,取上清液測定其在275 nm波長下的吸光度。另取1.0 mL酶液,按照上述步驟操作,以交換酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液的加入順序作為對照。

固定化酶的活力測定:將200 mg固定化酶(濕重)浸入1.0 mL磷酸緩沖溶液(0.03 mol/L,pH7.2)中代替上述1.0 mL酶液,其余步驟相同。

菠蘿蛋白酶活性定義為:1.0 g固定化酶或1.0 mL游離酶液在上述條件下水解酪蛋白,每分鐘產生1 μg酪氨酸,即為一個酶活力單位,表示為U。

相對酶活性(%)定義為:將某一組中測定的酶活性最高值記為100%,其他條件下測定的酶活性與最高酶活性的比值[16]。

1.2.4 單因素試驗 分別研究了PCMC與SA質量比、CaCl2溶液濃度、菠蘿蛋白酶濃度、戊二醛溶液體積分數以及交聯時間對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活的影響。固定CaCl2溶液濃度為1.0%、菠蘿蛋白酶濃度為2.0 mg/mL、戊二醛溶液體積分數為1.0%、交聯時間為60 min,考察不同PCMC與SA質量比(0∶5、1∶4、2∶3、3∶2、4∶1)對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活性的影響;固定PCMC與SA質量比為2∶3、CaCl2溶液濃度為1.0%、戊二醛溶液體積分數為1.0%、交聯時間為60 min,考察不同菠蘿蛋白酶濃度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活性的影響;固定PCMC與SA質量比為2∶3、菠蘿蛋白酶濃度為2 mg/mL、戊二醛溶液體積分數為1%、交聯時間為60 min,考察不同CaCl2溶液濃度(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活性的影響;固定PCMC與SA質量比為2∶3、CaCl2溶液濃度為1%、菠蘿蛋白酶濃度為2 mg/mL、交聯時間為60 min,考察不同戊二醛溶液體積分數(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活性的影響;固定PCMC與SA質量比為2∶3、CaCl2溶液濃度為1%、菠蘿蛋白酶濃度為2 mg/mL、戊二醛溶液體積分數為1%,考察不同交聯時間(20、40、60、80、100 min)對固定化菠蘿蛋白酶相對酶活性的影響。

1.2.5 固定化酶的穩定性研究

1.2.5.1 熱穩定性 分別取200 mg(濕重)優化工藝后制備的固定化酶(600 U)和3 mL游離酶(600 U)在不同溫度(40、50、60、70、80 ℃)下放置2 h,測定其活性,考察固定化酶和游離酶的熱穩定性。

1.2.5.2 酸堿穩定性 分別取200 mg(濕重)優化工藝后制備的固定化酶(600 U)和3 mL游離酶(600 U)在不同pH(3、5、7、9、11)環境下放置24 h,測定其活性,考察固定化酶和游離酶的酸堿穩定性。

1.2.5.3 重復使用性 按照優化后的固定化酶制備條件制備固定化菠蘿蛋白酶,將200 mg(濕重)固定化菠蘿蛋白酶(600 U)在相同條件下重復7次測定其活性,每次測完后用磷酸緩沖溶液將固定化酶清洗干凈。

1.3 數據處理

所有試驗數據重復3次取平均值,用Oringin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 菠蘿蛋白酶固定化條件的優化

2.1.1 PCMC與SA質量比對固定化酶活性的影響 PCMC與SA質量比對固定化酶活性的影響結果如圖1所示,當不添加PCMC時,固定化酶的相對酶活性只有46.8%,隨著PCMC和SA的質量比增加,固定化酶相對酶活性也隨之增加,在PCMC和SA的質量比為2∶3時達到最大值100%。繼續增加PCMC和SA的質量比,固定化酶的相對酶活性反而減小,這是因為PCMC含量過多時,相應的SA含量較少,形成的水凝膠珠不能很好的與Ca2+交聯,機械強度不夠,導致相對酶活性降低[17]。

圖1 PCMC與SA質量比對固定化酶活性的影響Fig.1 Effect of mass ratio of PCMC to SAon the activity of immobilized enzyme

2.1.2 CaCl2溶液濃度對固定化酶活性的影響 CaCl2溶液濃度對固定化酶活力的影響結果如圖2所示,隨著CaCl2溶液濃度的提高,固定化酶的相對酶活性呈現先增大后減小的趨勢,在濃度為1.0%時達到最大值100%。這可能是因為當濃度低于1.0%時,交聯程度不夠,水凝膠珠機械強度太弱,酶分子容易從水凝膠珠中滲漏出來[18],當CaCl2濃度高于1.0%時,高濃度的鈣離子充滿在水凝膠珠里面,抑制了菠蘿蛋白酶的活性。

圖2 CaCl2濃度對固定化酶活性的影響Fig.2 Effect of CaCl2 concentrationon the activity of immobilized enzyme

圖3 菠蘿蛋白酶濃度對固定化酶活性的影響Fig.3 Effect of bromelain concentrationon the activity of immobilized enzyme

2.1.3 菠蘿蛋白酶濃度對固定化酶活性的影響 菠蘿蛋白酶濃度對固定化酶活性的影響結果如圖3所示,當菠蘿蛋白酶濃度從1.0 mg/mL增加到2.0 mg/mL時,相對酶活性有一定程度的增加,但繼續增加酶濃度,相對酶活性變化不大,這可能是因為水凝膠上的吸附位點已經全部被酶分子占據,即使繼續增加酶濃度,相對酶活性也不會相應增加[19]。

2.1.4 戊二醛體積分數對固定化酶活性的影響 戊二醛的作用是將菠蘿蛋白酶分子交聯在水凝膠載體上[20],從而實現固定化,因此有必要考察戊二醛體積分數對固定化酶活性的影響。由圖4可知,隨著戊二醛體積分數的提高,固定化酶的相對酶活性呈現先增大后減小的趨勢,在戊二醛體積分數為1.0%時達到最大值100%。這是因為當戊二醛體積分數低于1.0%時,不能充分的將菠蘿蛋白酶分子交聯在水凝膠載體上,從而造成菠蘿蛋白酶分子的脫落。而當戊二醛體積分數高于1.0%時,過高濃度的戊二醛會使菠蘿蛋白酶分子交聯過度,造成菠蘿蛋白酶分子的空間結構發生改變,使酶失活[13],因此選擇戊二醛溶液的體積分數為1.0%。

圖4 戊二醛體積分數對固定化酶活性的影響Fig.4 Effect of glutaraldehyde volume fractionon the activity of immobilized enzyme

2.1.5 交聯時間對固定化酶活性的影響 交聯時間對固定化酶活性的影響結果如圖5所示。隨著交聯時間的增加,固定化酶相對酶活性呈現先增大后減小的趨勢。當交聯時間小于60 min時,交聯程度不夠,不能很好的固定菠蘿蛋白酶。但交聯時間大于60 min,菠蘿蛋白酶與水凝膠緊密結合,導致酶的活性位點不能很好的與底物分子結合,從而影響了酶的相對活性。因此,選擇交聯時間為60 min。

圖5 交聯時間對固定化酶活性的影響Fig.5 Effect of crosslinking timeon the activity of immobilized enzyme

2.2 固定化菠蘿蛋白酶的穩定性研究

2.2.1 固定化酶和游離酶的熱穩定性比較 由圖6可知,隨著溫度的升高,固定化酶和游離酶的相對酶活性都呈現減小的趨勢,但固定化酶的相對酶活性比游離酶的相對酶活性減小的更加緩慢,在50 ℃環境下放置2.0 h后,固定化酶的相對酶活性為89.3%,而此溫度下游離菠蘿蛋白酶的相對酶活性為48.3%;在80 ℃環境下放置2.0 h后,固定化酶的相對酶活性為35.2%,此時游離酶已幾乎檢測不到活性,說明固定化酶比游離酶具有更好的熱穩定性。這是因為菠蘿蛋白酶和水凝膠載體之間形成了共價鍵或氫鍵,酶活性位點的空間結構發生了改變,同時水凝膠載體對酶分子也有一定的保護作用[18]。

圖6 固定化酶和游離酶的熱穩定性比較Fig.6 Comparison of thermal stability betweenimmobilized enzyme and free enzyme

2.2.2 固定化酶和游離酶的酸堿穩定性比較 由圖7可知,游離菠蘿蛋白酶在pH大于5環境下放置24 h后,相對酶活性隨著pH的增加逐漸減小,在pH為11時,相對酶活性為42.3%。而固定化酶在pH3～11范圍內相對酶活性都大于83.0%。游離菠蘿蛋白酶在pH為5時最穩定,而固定化酶在pH為7時最穩定,說明菠蘿蛋白酶固定化后的穩定性向堿性方向移動。

圖7 固定化酶和游離酶的酸堿穩定性比較Fig.7 Comparison of pH stability ofimmobilized enzyme and free enzyme

2.2.3 固定化酶的重復使用性 固定化酶的重復使用性結果如圖8所示,隨著使用次數的增加,固定化酶的相對酶活性呈現減小的趨勢,這可能是因為少量酶分子與載體結合不牢固,使用過程中脫落,導致固定化酶活性降低。使用5次后,相對酶活性變化不顯著;使用7次后,固定化酶還保持起始酶活性的60.5%,說明固定化酶具有良好的重復操作穩定性。

圖8 固定化酶的重復使用性Fig.8 Reusability of the immobilized enzyme

3 結論

通過將菠蘿皮渣羧甲基纖維素和海藻酸鈉按照一定比例混合,以戊二醛為交聯劑制備固定化菠蘿蛋白酶。通過單因素實驗得出固定化菠蘿蛋白酶的最佳制備工藝為:菠蘿皮渣羧甲基纖維素與海藻酸鈉的質量比為2∶3,氯化鈣的濃度為1.0%,菠蘿蛋白酶濃度為2.0 mg/mL,戊二醛體積分數為1.0%,交聯時間為60 min。比較游離菠蘿蛋白酶和制備的固定化菠蘿蛋白酶的穩定性發現:固定化酶比游離酶更耐受高溫環境和堿性環境,且具有良好的重復操作穩定性。本實驗以菠蘿皮渣為原料,開發了一種新的固定化酶載體,所制備的固定化菠蘿蛋白酶具有較好的溫度穩定性和堿環境穩定性,有利于酶的工業化生產和儲存,對廢棄資源的高值化利用具有重要意義,同時也為其他酶的固定化研究提供理論基礎。