超高效液相色譜-串聯質譜法測定小鼠腫瘤組織中阿霉素藥物濃度

(1.國家納米科學中心，北京100190；2.島津企業管理(中國)有限公司，北京 100020)

阿霉素屬于蒽環類細胞毒性抗生素，抗癌譜廣且治療指數高，目前廣泛用于白血病及乳腺癌、結腸癌、肝癌等實體腫瘤的治療，是臨床常用的惡性腫瘤化療藥物之一，結構見圖1。但是，由于阿霉素在體內的代謝效果不佳，因而會產生一系列不良反應，在生物體內會產生嚴重的心臟毒性和骨髓抑制作用[1-3]，需要體內藥物濃度測定及病理分析等數據進行客觀評價。近年來，人們在研究阿霉素血漿藥物濃度的同時，其生物體內藥物濃度定量分析檢測也受到重視，兩者更好的結合能闡明阿霉素在體內代謝過程，有效地評價生物利用度[4-6]。

阿霉素在生物體內測定方法國內報道主要有HPLC-UV、熒光光度法、高效毛細管電泳法和高效液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)等方法[7-10]，而高效液相色譜-串聯質譜法報道較少。但這些方法均存在選擇性差、靈敏度低、分析時間長等缺點，技術要求復雜，不利于大量樣品的測定。本實驗采用正離子模式多反應監測(MRM)方式，建立了一種新的操作簡便、快速、靈敏、特異的高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法測定阿霉素在達腫瘤部位的藥物濃度的方法，并對其進行專屬性、線性范圍、檢測限、準確度、精密度、回收率和穩定性的考察，旨為進一步開發利用阿霉素在生物體內的分布奠定基礎。

圖1 阿霉素(C27H29NO11)的化學結構式

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

LC-MS/MS 8050液質聯用儀(日本島津公司)；電噴霧離子化電離源(ESI)、LabSolutions軟件(Ver.5.91)；BS224S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；HH-1型旋渦混勻器(北京賽歐華創科技有限公司)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)； DY89-II型玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Milli-Q ADVANTAGEA10純水儀(美國Merck Millipore 公司)。

1.2 試劑材料與實驗動物

MCF-7乳腺癌細胞系(中國協和醫科大學基礎醫學研究所)；DMEM高糖培養基，胎牛血清(Life Technology公司)；阿霉素標準品(廣州市左克生物科技發展有限公司)；柔紅霉素(北京沃凱生物科技有限公司)；甲醇(美國Fisher公司產品)；甲酸(美國Sigma公司)；固相萃取柱(日本島津公司)；其他試劑均為分析純，水為超純水。

25只雌性BALB/c-nu小鼠，體重(20±2)g，動物合格證號：SCXK(京)2016-0006由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件

Shim-Pack GISS-HP C18色譜柱(100mm×2.1mm×3μm)；流動相：A相為含0.1%甲酸的超純水，B相為甲醇；采用梯度洗脫程序：0～0.5min，10%～80%B；0.5～2.5min，80%～100%B；2.5～3min，100%B；3.1～7min，100%～80%B；柱溫40℃；流速0.2mL/min；進樣體積1μL。

1.3.2質譜條件

電噴霧離子源(ESI源)；掃描方式為多反應監測(MRM)，正離子電離模式；離子噴霧電壓：4.5kV；霧化氣(氮氣)流速：3.0 L/min；加熱氣(空氣)流速10L/min; 干燥氣(氮氣)流速：10L/min；脫溶劑管溫度250℃；加熱模塊溫度：400℃；離子源溫度：300℃；用于定量的離子分別為阿霉素m/z544.2→397.2，柔紅霉素(內標)m/z528→321。質量掃描范圍m/z100～1000。樣品測試前，使用調諧液校正質量軸。

1.4 實驗方法

1.4.1標準溶液和內標溶液的配制

精密稱取1.00mg阿霉素標準品，置于1mL容量瓶中，用超純水溶解稀釋并定容，配制成濃度為1.00 g/L的母液；然后用50%甲醇水再逐級稀釋成濃度分別為100、200、400、1000、5000、10000μg/L的工作液，置于4℃冰箱。

精密稱取1.00mg柔紅霉素標準品，置于1mL容量瓶中，用超純水溶解稀釋并定容，配制成濃度為1.00g/L的母液；取上述儲備液用50%甲醇水稀釋成濃度為15μg/L的內標溶液，置于4℃冰箱。

1.4.2細胞實驗：

DMEM高糖培養基，添加10%胎牛血清，細胞接種于100 mm2培養皿中，置于5% CO2培養箱，37℃培養，當細胞生長至融合度80%左右時傳代備用。

1.4.3動物實驗

選擇處于對數生長期的細胞，細胞達80～90%左右密度為宜，用胰酶消化細胞后用PBS清洗兩次，再用PBS吹打細胞沉淀至合適的濃度，細胞計數器進行計數。皮下瘤接種細胞量為1～5×106個細胞/只，接種體積為100μL，因此細胞懸液的濃度為1～5×107個細胞/mL，細胞與Matrigel基質膠1∶1混勻后，用胰島素注射器注入小鼠皮下。BALB/c-nu小鼠在標準環境下(濕度(50±10)%，溫度25±2℃，12h晝夜循環)進食進水，實驗前禁食12h。BALB/c-nu小鼠荷瘤后，待腫瘤體積長到約150mm3，按照0.2mg/kg劑量尾靜脈注射，開始給藥。

1.4.4樣品前處理

稱取2.5g勻漿后的樣品，加入80%乙腈10mL，旋渦震蕩，置于預置好的4℃高速冷凍離心機內4000r/min高速離心5min，取上清液待凈化。加入1mL甲醇，渦旋5min，超聲溶解15min。提前用甲醇水(1∶1)對固相萃取柱進行活化平衡，將待凈化液上樣至固相萃取柱進行過柱，依次用水、50%甲醇溶液各1mL淋洗，抽干。用甲醇洗脫，收集洗脫液用氮氣吹干，1mL初始流動相定容，經0.45μm濾膜過濾，上機待測。

1.4.5樣品采集與制備

將小鼠尾靜脈注射0.2mg/kg阿霉素，在2h后處死，取腫瘤組織，以蒸餾水洗凈，稱其質量；按質量-體積比1∶5向各組織中加入生理鹽水，冰上勻漿后，按照“1.4.4”項對樣品進行前處理后轉移至1.5mL Eppendorf管內，向每個樣品中加入10μL 15μg/L柔紅霉素內標溶液，用流動相定容至1mL；經0.45μm濾膜過濾，置于4℃冰箱中，上機待測。

2 實驗結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

取100μL空白小鼠的組織(腫瘤)勻漿清液于1.5mL Eppendorf管中。向每個樣品中加入不同質量的阿霉素配制成濃度分別為100、200、400、1000、5000、10000μg/L的系列標準溶液；加入10μL 15μg/L柔紅霉素作為內標，用移液槍混勻，再加入300μL甲醇，渦旋5min，以13000r/min離心10min，取上清液；經0.45μm濾膜過濾，進樣檢測。測得的阿霉素峰面積與內標柔紅霉素峰面積的比值Y對藥物濃度X進行線性回歸，繪制標準曲線。

2.2 專屬性考察

在電噴霧正離子模式下，總離子流圖見圖2。通過比較供試空白組織色譜圖、向空白組織中加入待測物和內標物后得到的總離子流圖(TIC)、提取離子流圖(EIC)和給藥后不同時間測得的色譜圖，待測藥物阿霉素和內標柔紅霉素的保留時間分別為1.49min和1.62min。結果表明，空白組織中所含內源性物質不干擾被測物及內標物的測定，被測物峰形良好。

圖2 腫瘤組織MRM質譜圖A.空白組織；B.空白組織加入阿霉素及內標柔紅霉素；C.小鼠尾靜脈注射阿霉素2h后腫瘤組織樣品；1.阿霉素；2.內標柔紅霉素

2.3 線性范圍及檢測限

按照“2.1”項下操作，進樣1μL，記錄色譜圖；以待測藥物濃度X(μg/L)為橫坐標，待測藥物與內標的峰面積比Y為縱坐標，用加權(w=1/X2)最小二乘法進行回歸計算，求得的直線回歸方程為：Y=0.00454786X-0.270637(r=0.9999580)。結果表明，阿霉素在腫瘤組織內藥物濃度在100～10000μg/L內，質譜響應的線性關系良好，以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，得阿霉素的LOD為0.56μg/L。

2.4 日內與日間精密度與方法回收率

取空白小鼠腫瘤組織提取液100μL，按 “1.4.1”項下分別配制阿霉素勻漿液高、中、低3個濃度(100、400、10000μg/L)的質量控制(QC)樣品，每個濃度進行5個樣本分析，連續測定3d，為保持實驗條件一致，標準曲線的測定與上述樣品測定同時進行。以當日的標準曲線計算QC樣品的濃度，將QC樣品的結果進行計算并分析，精密度和回收率結果見表1。結果表明：阿霉素在腫瘤組織提取液中的日內和日間精密度RSD均小于15%，方法回收率良好[11]，均可滿足2015版藥典四部通則中對于生物樣品定量分析方法驗證指導原則中相關規定。

表1 測定方法的精密度、準確度和回收率

2.5 穩定性考察

按“1.4.1”項下分別配制阿霉素腫瘤組織提取液高、中、低3個濃度的QC樣品，每個濃度進行3個樣本分析。分別將樣品在室溫(約20℃)下放置6h、4℃下冷藏8h、-20℃凍融循環3次，按“1.4.4”、“1.4.5”項下操作處理后進樣測定，考察小鼠的腫瘤組織提取液中阿霉素在室溫、冷藏、反復凍融條件下的穩定性。以每一濃度3個樣本分析，3種情況下穩定性樣品與新配制樣品的峰面積比值均在80%～120%之間，說明阿霉素在本研究考察的儲存條件下較穩定[11]。

表2 阿霉素在腫瘤組織基質中的穩定性(X±SD，n=3)

注：表中數據=(穩定性樣品峰面積/理論樣品峰面積)×100%

3 結論

本研究建立了LC-MS/MS在小鼠腫瘤組織測定阿霉素藥物濃度的方法，該方法簡便快速、專屬性強、靈敏度高、分析效率好，可彌補阿霉素類物質在紫外吸收差、檢測限值高的缺陷。另外樣品前處理是藥物分析的關鍵部分，由于生物樣品的介質組成比較復雜，如前處理不好，嚴重影響檢測結果，而本方法中采用先甲醇直接沉淀蛋白的方法對生物樣品進行預處理，同時結合固相萃取柱的方式，重現性好，回收率高，操作簡便，選擇沉淀蛋白的溶劑與所選用的流動相一致，不會有其他成分干擾，成本較低，為檢測創造了良好的條件。液相色譜儀結合色譜柱的使用，提高了色譜的分離效率，加快了分析速度。質譜檢測采用電噴霧正離子電離模式，在尾靜脈注射阿霉素小鼠的腫瘤部位能檢出阿霉素，阿霉素定量范圍在100～10000μg/L之間。該方法適用于生物樣品中阿霉素類成分的高通量分析。