珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)安絲菌素P-3的分離純化工藝優(yōu)化

吳興可，祁荃，卞婷婷，劉蘇煜，谷藝明，郭靜，蔡志強

（常州大學制藥與生命科學學院，江蘇常州213164）

安絲菌素（ansamitocin）主要是通過珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生的苯安莎類抗生素[1]，具有良好的抗腫瘤活性[2]。它是一種19元環(huán)的大環(huán)內酯類化合物，根據(jù)其C-3 位側鏈R 基的不同，可分為AP-1、AP-3、AP-2、AP-3’和AP-4 這五個部分，其中AP-3是主要成分之一且其抗腫瘤細胞毒性最強[3]，可用于抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）的研發(fā)[4]，其化學結構如圖1所示。據(jù)報道，安絲菌素微生物發(fā)酵水平較低，純化工藝復雜，分離提取成本高，因此提高回收率，簡化純化工藝，是目前迫切需要解決的問題[5-6]。

圖1 安絲菌素結構式

近幾年，學者主要通過誘變菌株、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基或改造基因、代謝節(jié)點等[7-9]來提高AP-3的發(fā)酵產(chǎn)量。在分離純化上，傳統(tǒng)方法有柱色譜法，但是該法有很多局限性，工藝繁瑣，得率低；到20世紀80 年代發(fā)展起來的高效逆流色譜法與傳統(tǒng)方法不同，是無需固體填料的高效分離技術，該法獲得安絲菌素P-3 純度達98%以上，回收率為80%，然而成本較高[10]；美國一份專利[11]通過對發(fā)酵液進行熱滅活處理后再進行分離純化，另一份免疫基因公司申請專利[12]通過添加氯仿來使微生物滅活，再用硅膠柱和氧化鋁柱吸附層析，發(fā)現(xiàn)對發(fā)酵液進行適當預處理后會顯著降低后期分離純化難度，由于專利保護或用于商業(yè)用途該結果沒有對外公開。

微生物發(fā)酵生產(chǎn)的安絲菌素發(fā)酵液組成成分繁多且復雜，除了發(fā)酵產(chǎn)品AP-3 之外，還包括所培養(yǎng)的微生物菌體（菌絲、菌球）及未利用的培養(yǎng)基成分、發(fā)酵過程中的副產(chǎn)物等，主要是色素及易溶于有機溶劑中的酶等。這些雜質的存在會給安絲菌素的分離純化帶來困難，影響目標物質的回收率和質量，所以在分離提取前，必須對發(fā)酵液進行預處理。

本文通過對安絲菌素發(fā)酵液進行菌體分離、酸處理、活性炭吸附及解吸附等一系列預處理，有效地去除了發(fā)酵液中的菌體、雜蛋白質及色素，然后利用中性氧化鋁對處理過的收集液進行分離純化，建立了快速分離純化安絲菌素P-3的方法。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

珍貴橙色束絲放線菌變種（Actinosynnema pretiosumssp.auranticumB126-29） 為 本 實 驗 室DES化學誘變所得的安絲菌素生產(chǎn)菌株。

種子培養(yǎng)基：甘油10g/L，葡萄糖5g/L，酵母膏10g/L，牛肉膏10g/L，氯化鈉3g/L，pH=7.4，115℃滅菌30min。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油20g/L，蔗糖25g/L，玉米漿10g/L，前體異丁醇2g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，七水合硫酸亞鐵0.01g/L，pH 7.4，115℃滅菌30min。

1.2 材料與儀器

發(fā)酵液：實驗室保藏的珍貴橙色束絲放線菌變種（Actinosynnema pretiosumssp.auranticumstrain B126-29）二次活化后接種于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，220r/min 發(fā) 酵7 天 所 得；AP-3 標 準 品（HPLC 級，購于藥明康德天津分公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀；R1001-VN 旋轉蒸發(fā)儀，PB-10 酸度計；S53 紫外可見分光光度計；硅藻土過濾裝置實驗室自制；牛血清蛋白質、考馬斯亮藍、活性炭、硅藻土購于上海生工。

1.3 測定方法

1.3.1 液相色譜條件

UV 檢測器；檢測波長為254nm；色譜柱為EclipseXDB-C18柱（250mm×4.6mm×5μm），柱 溫25℃；流動相為甲醇-水（體積比70∶30），流速0.8mL/min；進樣量20μL。

1.3.2 標準曲線的繪制

稱取適量AP-3 標準品溶于甲醇中，將其配制成800mg/L 的標準液作為母液，按梯度稀釋成0、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L 濃度的標準溶液，使用0.22μm的微孔濾膜過濾，在1.4.1節(jié)的色譜條件下平行測定3 次，平均峰面積為橫坐標，AP-3標準液的質量濃度為縱坐標，繪制濃度-峰面積標準曲線，計算線性方程，標準曲線如圖2所示。

AP-3標準曲線方程為y=0.031x-4.62（R2=0.9999）線性擬合良好，可用于發(fā)酵液中AP-3含量的計算。

圖2 AP-3的HPLC標準曲線

1.3.3 AP-3濃度測定

從搖瓶中吸取5mL 發(fā)酵液，加入等體積乙酸乙酯充分混合震蕩后8000r/min 離心5min，吸取上層乙酸乙酯層，如此反復萃取三次后，在45℃下進行旋蒸，蒸干后溶于1mL甲醇（HPLC 級）充分溶解后過0.22μm的微孔濾膜，根據(jù)1.4.2節(jié)標準曲線計算發(fā)酵液中AP-3的含量[13]。

1.3.4 除菌量的測定

取適量發(fā)酵液，稀釋，測量發(fā)酵液在波長660 nm 處的光密度值，控制在0.3～0.8 范圍內；測量值乘以稀釋倍數(shù)，即為發(fā)酵液中菌體生物量，從而確定菌體的去除率。

1.3.5 雜蛋白質測定

采用考馬斯亮藍G-250法[14]。

1.3.6 計算公式

安絲菌素P-3 的除菌率，生產(chǎn)過程安絲菌素P-3的回收率、除雜蛋白質率、脫色率、吸附率的計算如式(1)～式(5)。

1.4 實驗方法

1.4.1 發(fā)酵液的預處理

（1）硅藻土添加量的影響 將濾紙浸濕后，鋪于抽濾漏斗的底部，將硅藻土與水的均勻混液倒入鋪好濾紙的漏斗內，待硅藻土沉淀后，開啟真空泵進行真空抽濾，抽濾壓力為0.1MPa。硅藻土形成1～2cm 厚涂層且其表面水抽盡后，倒入發(fā)酵液，在不換硅藻土濾層的情況下，連續(xù)抽濾3次。硅藻土也可作為助濾劑，將硅藻土與發(fā)酵液進行混合后再進行過濾，添加量分別為5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L。將沒有添加硅藻土的發(fā)酵液作為對照，取少量發(fā)酵液8000r/min，離心5min，除菌體和雜質得到上清液，采用1.3.4 節(jié)和1.3.5 節(jié)的方法比較抽濾和離心對除雜蛋白質和除菌效果的影響，同時采用1.4.3節(jié)中的AP-3測定方法計算回收率，比較兩種方法對AP-3含量的影響。

（2）不同pH對發(fā)酵液雜蛋白質、AP-3含量的影響 考察不同酸性條件下pH 分別為2、3、4、5、6時的除蛋白質率及回收率，考察不同pH對發(fā)酵液雜蛋白質、AP-3含量的影響。

（3）發(fā)酵液脫色波長的確定 發(fā)酵液成分復雜，將抽濾所得發(fā)酵液，稀釋成不同濃度，分別在波長380nm、400nm、420nm、440nm、460nm處測其吸光度，繪制圖譜，選擇線性關系最好的波長作為測定AP-3發(fā)酵液色素的最佳波長[15]。

（4）活性炭吸附條件的優(yōu)化 采用單因素優(yōu)化實驗，分別考察活性炭添加量（1g/L，5g/L，10 g/L，15g/L，20g/L）、吸附溫度（30～70℃）、吸附時間（0～150min）對濾液色度以及AP-3 含量的影響。

（5）活性炭吸附安絲菌素的脫附 收集吸附安絲菌素發(fā)酵液的活性炭于錐形瓶中，加入不同種類的有機溶劑洗脫液后，密封，室溫下震蕩洗脫，靜置后過濾洗脫液，測其安絲菌素P-3含量。

1.4.2 中性氧化鋁柱層析

將上述洗脫液進行減壓旋蒸濃縮呈浸膏狀后加入其質量1.2～1.5倍的中性氧化鋁（200～300目），然后加入適量乙酸乙酯后使兩者混合均勻，減壓旋蒸后，得到柱層析所需上樣樣品，濕法裝柱后干法上樣，再進行梯度洗脫，收集含有AP-3 的洗脫液后，減壓旋蒸濃縮后，甲醇（HPLC 級）定容后過0.45μm濾膜，4℃保存待測。

1.4.3 重結晶

用少量正己烷溶解上述純化AP-3濃縮品，然后超聲至白色混濁物出現(xiàn)，最后在4℃下靜置5～24h使其重結晶，如此反復得到純度較高的AP-3。

1.4.4 質譜（MS）

用含有0.1%甲酸的50%甲醇溶液溶解重結晶后的樣品后，選擇H+、Na+和K+離子測試。

1.4.5 核磁共振（NMR）

將重結晶后的高純樣品溶于0.5mL的氘代氯仿中，裝入干凈的核磁管中，在300MHz下測H1NMR。

1.5 結晶

將脫色過程中收集的流出液減壓濃縮再結晶，得到白色粉狀結晶物，置于真空干燥箱中50～60℃烘干后得到結晶。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵液的預處理

2.1.1 硅藻土添加量的影響

由圖3可知，用涂有硅藻土涂層的抽濾裝置進行抽濾時，發(fā)現(xiàn)抽濾效果比離心效果要好，但是回收率較低，這可能是因為硅藻土作為吸附劑除了吸附發(fā)酵液中的菌體和雜蛋白質，還會吸附部分AP-3，使得回收率降低。通過離心去除菌絲體后乙酸乙酯直接萃取上清液中的AP-3 發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量降低，推測可能是因為菌絲體較黏吸附了部分AP-3，乙酸乙酯直接萃取上清液會損失部分菌絲體上的AP-3。硅藻土除了作為吸附劑外，還可作為助濾劑，添加不同濃度的硅藻土發(fā)現(xiàn)不僅除雜蛋白質率有所提高，AP-3 的回收率也有提高，這與其他文獻研究結果相似[16]。在10g/L 時，回收率達到最大，因此本文作者選擇10g/L作為硅藻土的添加量，此時除菌率為89.85%，除雜蛋白質率為54.12%，回收率為96%。

圖3 硅藻土添加量對發(fā)酵液中雜質的影響

2.1.2 不同pH 對發(fā)酵液中雜蛋白質、AP-3 含量的影響

由圖4可知，pH為2時，蛋白質析出最多，除蛋白質率最高。隨著pH 升高，除蛋白質率逐漸降低，說明酸性條件下蛋白質更易變性沉淀，pH為3時AP-3的回收率達到最大，隨后隨著pH的提高逐漸降低，AP-3 在弱酸性條件下更易溶于乙酸乙酯中，可能是因為pH 下降，黏度下降，菌體纏繞AP-3能力降低，使得菌絲體上AP-3更易被萃取出來[17]。當pH 為2 時，AP-3 產(chǎn)量降低，可能是強酸性條件下AP-3不易溶于有機溶劑[18]，使得AP-3萃取量降低。因此選擇pH 為3 時對發(fā)酵液進行雜蛋白質預處理，此時除雜蛋白質率為68.2%，回收率為83.8%。

2.1.3 發(fā)酵液脫色波長的確定

發(fā)酵液濃度與吸光度關系見圖5及表1。

圖5 脫色波長的確定

表1 不同波長下的相關系數(shù)

由表1可知，波長420nm時線性系數(shù)最好，故后續(xù)步驟用420nm作為活性炭脫色檢測波長。

2.1.4 活性炭質量濃度對發(fā)酵液的影響

添加濃度1～2g/L 的活性炭，在恒溫水浴60℃下加熱1h后，離心取上清液測其脫色率及吸附率，結果見圖6。

圖6 活性炭加入量對發(fā)酵液的影響

由圖6可知，隨著活性炭用量增加，脫色率不斷增加，增加到一定程度之后就趨向穩(wěn)定，是因為活性炭屬于物理吸附，當吸附到一定程度之后其內部達飽和狀態(tài)，很難再吸附色素。隨著活性炭質量濃度的增加，脫色率顯著增加，回收率明顯升高。當質量濃度為20g/L 時，回收率劇增，發(fā)酵液已幾近無色，于是選擇20g/L 濃度活性炭，此時脫色率達93.06%，吸附率達90.31%。

2.1.5 溫度及脫色時間對脫色效果影響

由圖7可知，溫度升高能減小體系的黏度，加速分子的熱運動，促使色素分子間碰撞機會增加，有利于加速活性炭對色素的吸附作用；隨著脫色溫度的升高，發(fā)酵液脫色率逐漸增大，60℃后沒有明顯的變化趨勢，說明活性炭對色素的吸附達飽和狀態(tài)，此時脫色率為91.63%。AP-3 的回收率隨著溫度的升高逐漸緩慢降低，但是變化不大，說明活性炭吸附已趨于平衡狀態(tài)，當溫度達到70℃時回收率明顯降低，可能是溫度過高導致安絲菌素降解。于是選擇60℃下對發(fā)酵液進行活性炭脫色處理，此時吸附率達89.45%。

圖7 脫色溫度對發(fā)酵液的影響

由圖8可知，隨著脫色時間的延長，脫色率升高，表明被吸附物質與活性表面接觸機會越多[19]，當脫色時間到達2h 時，安絲菌素被全部吸附，大部分色素被全部脫除，隨著脫色時間的延長活性炭吸附達到平衡狀態(tài)，脫色率為93.12%，得率100%，于是選擇2h作為脫色最佳時間。

圖8 脫色時間對發(fā)酵液的影響

2.1.6 安絲菌素洗脫劑的選擇

由表2可知，選取上述三種有機溶劑進行洗脫時，發(fā)現(xiàn)只有乙酸乙酯未有色素洗脫出來。推測可能色素吸附在活性炭內部，孔道內有水阻隔色素與乙酸乙酯接觸，上述洗脫劑中，安絲菌素更易溶于乙酸乙酯，導致安絲菌素較色素更易被洗脫出來。

2.1.7 安絲菌素洗脫時間的選擇

活性炭的吸附與脫附同時進行，在一定時間下會達到動態(tài)平衡。

表2 不同洗脫劑對活性炭吸附安絲菌素的洗脫效果

由圖9 可知，隨著時間的延長，AP-3 的洗脫率逐漸增大，當達到2h 時，安絲菌素的洗脫率不再發(fā)生變化，說明已達到動態(tài)平衡，于是選擇2h作為洗脫時間，此時AP-3的洗脫率為81.28%。

圖9 活性炭吸附安絲菌素的洗脫過程

2.2 中性氧化鋁柱層析結果

由表3可知，對發(fā)酵液進行預處理后，更易進行中性氧化鋁柱層析，消耗有機溶劑總體積720mL（溶劑用量327mL/mg 產(chǎn)物），與文獻[20]直接柱層析后消耗有機溶劑1680mL（溶劑用量763mL/mg產(chǎn)物）相比，其消耗體積顯著降低，可見極性較大的物質并未完全分離出來，但是含量相對減少，此時AP-3純度86.15%，洗脫率80.36%。

表3 中性氧化鋁柱層析梯度洗脫消耗溶劑體積

2.3 質譜（MS）與核磁共振（NMR）結果

分離純化后再重結晶得到AP-3 純品，經(jīng)過HPLC 檢測得到其純度達95%，AP-3 總體收率為78.5%，溶劑用量為347mL/mg AP-3。因此對其進行了MS 和1H NMR 分析（如圖10），ESI 質譜數(shù)據(jù)顯 示，[M+H]+(m/z)為635.27，[M+Na]+(m/z) 為657.26，[M+K]+(m/z)為701.49，證明發(fā)酵產(chǎn)物提取分離得到的確為AP-3。

3 結論

圖10 純化所得AP-3的MS、1H NMR圖

為了提高分離純化AP-3 的效率，本研究通過對發(fā)酵液進行預處理，以除去發(fā)酵液中的雜蛋白質及色素。本文用抽濾的方法代替了傳統(tǒng)的離心方法，有效地去除了發(fā)酵液中的菌體雜質等。通過酸化發(fā)酵液，去除發(fā)酵液中的大量雜蛋白質，對發(fā)酵液進行了有效預處理，同時通過單因素實驗考察活性炭吸附發(fā)酵液中色素的最佳條件，采用乙酸乙酯脫附來達到快速分離純化的目的。除此之外，發(fā)現(xiàn)活性炭還可以重復利用，選取的脫附劑乙酸乙酯相較于其他有機試劑其毒性也小，此時AP-3的洗脫率為81.28%。最后采用中性氧化鋁柱層析，消耗有機溶劑總體積720mL，洗脫率80.36%，此時AP-3 純度86.15%。分離純化后的AP-3 經(jīng)重結晶后其純度可達95%以上，經(jīng)過MS 和1H NMR 分析可確定發(fā)酵產(chǎn)物提取分離得到的確為AP-3。本文從多角度研究純化安絲菌素P-3的方法，該方法既快速又環(huán)保。另外本文為快速分離純化安絲菌素也提供了新的方法及思路。