不同蛋白微射流噴霧干燥制備魚油微膠囊性能研究

李 楊 徐靜雯 于靜雯 郭增旺 滕 飛 王中江

(東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

0 引言

魚油是ω-3多不飽和脂肪酸，如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的良好來源，對各種疾病的預防和治療具有積極作用[1-4]。但是，由于魚油中不飽和脂肪酸的含量極高，易發生氧化，產生酸、醛、酮類以及各種氧化物等，并產生異味，降低了脂質的營養質量[5]。微膠囊技術可使魚油與外界環境隔絕，進而有效地保護不飽和脂肪酸不被氧化，并改善食品中ω-3脂肪酸的穩定性和釋放性[6]。微膠囊特性易受乳液制備條件影響，因此對乳液穩定性起著關鍵作用，魚油乳液粒徑越小，乳液均一性和穩定性越好，微膠囊產品的包埋率越高[7]。與傳統高壓均質技術相比，微射流技術壓力更高、碰撞能力更大、流體速度更快，乳化劑或表面活性物質對油滴暴露出更多的疏水基團或結合位點，制備出的乳液更穩定、更均勻[8]。已有學者應用微射流技術進行了相關研究[9-10]。

在微膠囊制備過程中，壁材的選擇對噴霧干燥生產微膠囊產品至關重要[11]。近年來，乳清蛋白(WPI)和大豆蛋白(SPI)被廣泛用作包埋油脂的壁材，這些蛋白具有良好的乳化特性和成膜性能，能在乳化過程中展開結構、吸附到油水界面，形成阻止油滴合并的包裹層，以斥力作用穩定所形成的乳液[12]。豌豆分離蛋白(PPI)與大豆蛋白相似，可作為微膠囊化的新型壁材[13]。文獻[14]用WPI和卵磷脂制備的微膠囊表現出良好的包埋率和再分散性。文獻[15]用大豆蛋白成功地包埋了魚油，研究了乳化過程和蛋白質與油比率對微膠囊性質和油脂穩定性的影響。文獻[16]使用PPI作為乳化劑，與麥芽糊精一起包埋Miglyol 812N(一種中鏈甘油三酯)進行了研究。單一壁材大多數很難制備出高包埋率的魚油微膠囊，因此實際應用中往往根據壁材各自的物理化學特性，將兩種或兩種以上壁材進行復配。麥芽糊精乳化性差，但因具有補充包埋、增強油脂抗氧化性等功能而常作為壁材填充劑[17]。卵磷脂作為一種天然的表面活性劑，具有兩親分子結構，常被用作功能性乳化劑來改善食品乳狀液的乳化效果[18]。

本文用乳清分離蛋白、大豆分離蛋白、豌豆分離蛋白分別與麥芽糊精作為復合壁材，卵磷脂作為乳化劑包埋魚油，經微射流處理后進行噴霧干燥，以制備魚油微膠囊，對不同蛋白制備的微膠囊性能進行比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(蛋白質量分數91.6%)、魚油(含二十碳五烯酸8.48%、二十二碳六烯酸15.85%)，均購自山東禹王實業有限公司；豌豆分離蛋白(蛋白質量分數82.1%)，西安維珍生物科技有限公司；乳清分離蛋白(蛋白質量分數92.1%)，鄭州明瑞化工產品有限公司；麥芽糊精，廣州成碩生化試劑有限公司；卵磷脂，上海源葉生物科技有限公司；SDS(十二烷基硫酸鈉)、石油醚、乙醇、無水乙醚、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Ultra-Turrax T25型高速分散器，德國IKA公司；M-110EH30型高壓微射流均質機，上海鯉躍精密機械貿易有限公司；BL-6000Y型噴霧干燥機，上海比朗儀器制造有限公司；S-3400N型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；VERTEX 70型傅里葉變換紅外光譜儀，德國BRUKER公司；Pyris 1 TGA型熱重分析儀，美國PERKINELMER公司；UV-2600型紫外分光光度計，日本島津公司；Bettersize2000型激光粒度分布儀，丹東市百特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1乳液和微膠囊的制備

根據文獻[19]的方法進行適當修改。將蛋白與麥芽糊精以質量比3∶1溶于600 mL溫水中，固形物質量分數為8.6%。同時使3 g卵磷脂完全溶于魚油中，蛋白與魚油料液比為3 g/mL，再將加入乳化劑的魚油倒入壁材溶液中進行乳化處理。先經高速分散機在12 000 r/min條件下高速乳化10 min后再用微射流40 MPa處理10 min，將乳化后的乳狀液用噴霧干燥法制成魚油微膠囊，進口溫度為180℃，出口溫度為80℃，流速為6 mL/min。

1.3.2乳液粒徑

乳液顆粒大小分布采用激光粒度儀測定，以去離子水作為分散介質，結果基于顆粒折射率1.450、顆粒吸收率0.001計算。

1.3.3乳化活性與乳化穩定性測定

將復合壁材配制成0.02 g/mL溶液，取9 mL樣品與3 mL魚油混合，用高速分散機在10 000 r/min的條件下乳化1 min，然后從底部取50 μL乳狀液，立即加入5 mL 0.1% SDS溶液，混勻后在500 nm處測定其吸光度A0，以SDS溶液作空白對照[20]。從0 min開始每隔10 min測定一次吸光度At，共測6次。乳化活性指數(EAI)和乳化穩定性指數(ESI)計算公式為

(1)

(2)

式中EAI——乳化活性指數，m2/g

ESI——乳化穩定性指數，%

c——蛋白質量濃度，g/mL

V——稀釋倍數

θ——乳狀液中油相體積分數，取25%

1.3.4微膠囊包埋率測定

微膠囊表面油含量測定參照文獻[21]的方法。稱取1.5 g微膠囊粉末(質量m)，加入30 mL沸程30～60℃石油醚輕微振蕩5 min，浸提后過濾。濾渣用15 mL石油醚洗滌后過濾。將濾液全部轉移至質量恒定的圓底燒瓶(質量m1)中，旋轉蒸發石油醚，105℃干燥至質量恒定(質量m2)。表面油質量分數計算公式為

(3)

微膠囊總油含量測定參照文獻[21]的方法。稱取1 g微膠囊粉末(質量m3)，充分溶解于10 mL 60℃熱水中，冷卻至室溫(20℃)，加入1.25 mL氨水，65℃水浴5 min，冷卻后加入10 mL無水乙醇，振蕩1 min，再加入無水乙醚和石油醚各25 mL，振蕩1 min，4 800 r/min離心15 min，將上清液轉移至質量恒定的圓底燒瓶(質量m4)中，旋轉蒸發萃取液，105℃干燥至質量恒定，置于干燥器中冷卻至室溫后稱量(質量m5)。總油質量分數計算公式為

(4)

微膠囊包埋率計算公式為

(5)

1.3.5微觀結構

將不同壁材的微膠囊粉末粘在有雙面膠的操作臺上，離子濺射鍍金，然后用掃描電子顯微鏡(SEM)在5 kV電壓下觀察微膠囊的微觀結構。

1.3.6紅外光譜

將樣品與KBr經干燥處理后,稱取約5 mg樣品與200 mg KBr研磨均勻,然后壓片,測定傅里葉變換紅外光譜。掃描范圍4 000～500 cm-1,分辨率4 cm-1, 掃描次數32次。采用Peakfit 4.12軟件對譜圖酰胺Ⅰ帶1 600～1 700 cm-1波數范圍內特征峰進行分析。

1.3.7氧化穩定性

將魚油微膠囊粉末放在棕色試劑瓶中，在60℃的密閉容器內進行加速氧化試驗，每隔5 d測定樣品的過氧化值。

參照文獻[22]的方法進行過氧化值的測定。稱取樣品2～3 g(精確至0.001 g)置于250 mL碘量瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液(體積比2∶3)，輕輕振搖使試樣完全溶解。加入1 mL飽和KI溶液，塞進瓶塞，并輕輕振搖0.5 min，放置在暗處3 min。取出后加100 mL水，搖勻后立即用0.01 mol/L Na2S2O3標準溶液滴定至淡黃色時，加1 mL 0.01 g/mL淀粉指示劑，繼續滴定并快速攪拌至溶液藍色消失為終點。進行3次平行實驗，并以SDS溶液作空白實驗。過氧化值計算公式為

P=1 000(V2-V1)N/W

(6)

式中P——過氧化值，mmol/kg

V1——空白消耗Na2S2O3標準溶液體積，mL

V2——樣品消耗Na2S2O3標準溶液體積，mL

N——Na2S2O3標準溶液濃度，mol/L

W——樣品質量，g

1.3.8熱穩定性

用Pyris 1 TGA型熱重分析儀分析不同壁材制備的魚油微膠囊間熱穩定性差異。在氮氣流(30 mL/min)下將樣品(5 mg)從30℃ 加熱至500℃(10℃/min)。

1.4 數據處理與分析

采用Origin 9.0軟件進行制圖，采用軟件SPSS 22.0對3次平行實驗的數據進行顯著性分析(P<0.05表示差異顯著)和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 乳液粒徑

平均粒徑直接地反映出乳液中液滴的大小，液滴大小對乳液性質有很大影響，PDI(聚合物分散性指數)表征液滴分散情況，PDI越小，液滴分散性越好，體系越穩定[23]。粒徑分布曲線中具有單峰分布以及峰較窄或峰下面積較小的乳液表示均勻且穩定的乳液[24]。由圖1(圖中不同小寫字母表示差異顯著)可知，WPI制備的乳液平均粒徑和PDI顯著小于SPI和PPI乳液(P<0.05)。從圖1可以看出所有乳液粒徑分布曲線基本都呈單峰，說明3種蛋白均顯示出良好的乳化能力以形成細乳液。同時，乳液中液滴的尺寸越小，蛋白質的乳化能力越高，說明WPI和PPI的乳化能力較好，而SPI的乳化能力較差。根據粒徑分布曲線可以看出，SPI和PPI乳液的平均粒徑較高主要是由于存在高度絮凝的油滴，其粒徑大于5 μm，文獻[25]也得出相同的結果，SPI乳液比其它菜豆分離蛋白穩定的乳液具有更高的絮凝傾向。文獻[26]指出，WPI比SPI制備的乳狀液平均粒徑更小，體系穩定性更優。而在相似濃度下，PPI制備的乳液液滴比用SPI制備的乳液液滴更小，使得SPI成為較差的乳化劑[27]。

圖1 蛋白種類對魚油乳液平均粒徑、PDI和粒徑分布的影響

2.2 乳化活性和乳化穩定性

在親脂性成分作為微膠囊芯材的情況下，包封材料具有良好的乳化性能是基本要求。乳化活性是蛋白質吸附到界面能力的量度，而乳化穩定性是測量在限定時間段內吸附層的穩定性。3種壁材的乳化活性和乳化穩定性如圖2所示。3種壁材的乳化活性和乳化穩定性都隨著時間的增加而下降。從圖2中可以看出，WPI的乳化活性最好，PPI的乳化活性較SPI強一些(P<0.05)，與粒徑結果一致。在測定的50 min內，WPI的乳化穩定性顯著高于SPI和PPI(P<0.05)，對于SPI和PPI，20 min前PPI的乳化穩定性下降趨勢較緩，30～40 min時SPI的表現更好(P<0.05)，50 min時兩者的乳化穩定性無顯著差異(P>0.05)。蛋白質的組成和結構影響它們在界面處不同構象變化的吸附和適應，乳清蛋白無序結構含量高，分子柔性好，可在油水界面產生更好的構象變化，表現出更高的乳化活性和穩定性[20]。在低離子強度條件下，來自菜豆的7S球蛋白在pH值4.2～7.0下表現出比大豆更好的溶解性、乳化能力和乳化穩定性[28]。文獻[29]也指出在較低的油濃度(質量分數小于10%)下，PPI通過提供更小的液滴，表現出比SPI更好的乳化能力。

圖2 不同壁材的乳化活性和乳化穩定性

2.3 包埋率

表面油含量和包埋率是判斷微膠囊質量的重要指標，有較高包埋率的微膠囊對魚油的保護作用較好，而表面油含量與包埋率呈負相關。不同蛋白制備的魚油微膠囊包埋率如表1所示。結果表明，WPI制備的魚油微膠囊包埋率最高(95.34%)，較SPI和PPI分別高出4.11、7.63個百分點(P<0.05)，且表面含油率最低(1.68%)，較SPI和PPI分別低1.11、1.87個百分點(P<0.05)。所以，以WPI為壁材的微膠囊包埋效果最好，SPI次之，PPI最差。結合圖3分析可能是因為SPI和PPI顆粒表面有凹陷增大了表面積且存在少量孔洞導致對魚油的包埋效果不好。乳清蛋白的包埋率最高，可能與乳液粒徑有關。具有更小粒徑的原始乳液經噴霧干燥后得到的粉末能包裹住更多的油，且粉末表面的游離油更少[30]。文獻[31]的研究結果表明，以豌豆分離蛋白和改性淀粉復合物比以合成乳化劑Tween 20和SDS制備的DHA微膠囊液滴尺寸小，顯示出更少的微膠囊表面油、更高的包埋率和更少的氧化。

表1 不同蛋白制備的魚油微膠囊性質比較

注：同一列不同字母表示數值間有顯著性差異(P<0.05)。

2.4 掃描電子顯微鏡

用3種蛋白制備的魚油微膠囊表面形態可以通過掃描電子顯微鏡觀察。從圖3中可以看出相同處理下，不同蛋白制成的魚油微膠囊在表面結構和大小上存在一定的差異。圖3a和圖3c中顆粒表面都有明顯的凹陷，圖3b中大部分顆粒均呈球形，大小均一且表面凹陷較少。同時，用SPI和WPI制備的膠囊表面無孔洞，而用PPI制備的膠囊表面有少量孔洞。微膠囊表面的凹痕可能是由噴霧干燥過程中高溫使膠囊內部的空氣膨脹引起內外氣壓的不同，當冷卻時壁材收縮所致[32]，是噴霧干燥法制備微膠囊的普遍特征。在高噴霧干燥速率下，干燥顆粒內部空氣或蒸汽的熱膨脹可以平整凹痕，但也可能使囊膜破裂，導致孔洞的形成[33]。穩定的乳液可以避免熱膨脹或機械力引起的破裂，乳液的穩定性與粒徑直接相關，所以平均粒徑較小、粒徑分布較窄的WPI乳液穩定性更好，形成的微膠囊顆粒更完整。但是，同一樣品中微膠囊顆粒大小也存在一定差異，這與乳液從高壓噴槍中噴出時的霧滴大小有直接關系[34]。文獻[24]的研究發現來自蕓豆、紅豆和綠豆3種分離蛋白的微膠囊化性質比大豆分離蛋白差，盡管它們的乳化能力更優，原因在于微膠囊化性質主要與界面性質有關，尤其是界面蛋白質濃度。SPI在界面處有更好的吸附與較高量的吸附蛋白質相關，并形成相對較好的粘彈性界面膜。

圖3 不同蛋白制備的魚油微膠囊表面形態

2.5 紅外光譜分析

圖5 酰胺Ⅰ帶的FTIR曲線和高斯曲線擬合圖譜

圖4 魚油微膠囊紅外光譜圖

表2 酰胺Ⅰ帶曲線擬合結果及譜帶指認

注：同一行不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

2.6 氧化穩定性

過氧化值是評價魚油氧化程度的重要指標，在儲存期內過氧化值的變化小說明壁材能夠有效地將魚油包埋，降低魚油被氧化的幾率。從圖6中可以看出，3種蛋白制備的魚油微膠囊過氧化值都隨著時間的延長而增加，其中以乳清蛋白為壁材的微膠囊表現出較好的氧化穩定性，過氧化值的變化最小。WPI的主要成分是β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，它們含有半胱氨酰殘基、二硫鍵和巰基官能團，可以清除自由基以抑制脂質氧化[41]。另外，顆粒表面的孔洞會增加微膠囊對環境氣體的通透性，降低芯材的抗氧化性，同時高含量表面油與空氣直接接觸也會加速氧化，所以SPI和PPI制成的微膠囊表面有凹陷或孔洞，表面油含量高，導致它們在氧化穩定性上的表現較WPI稍差。

圖6 魚油微膠囊氧化穩定性

2.7 熱穩定性

圖7 魚油微膠囊熱重曲線

通過熱重分析比較魚油微膠囊之間的熱穩定性差異(圖7)。根據熱重曲線，膠囊的熱解過程大致可分為4個階段，首先是30～105℃，3類微膠囊的質量損失率大約都為4%，這部分損失主要由微膠囊中自由水的蒸發導致；第2階段為105～200℃，該階段主要是結合水和揮發性分解物的損失，質量損失率約為9%；第3階段為200～350℃，該階段失重明顯。溫度高于200℃時，壁材和魚油都開始分解失重[42]，化學鍵斷裂，產生CO2、H2O和CH4等中間產物，壁材被破壞，芯材加速釋放。由圖7可以看出，溫度達到320℃前，SPI和PPI為壁材的微膠囊質量損失都小于WPI為壁材的微膠囊，繼續升溫，PPI制備的微膠囊質量損失加快，超過WPI制備的微膠囊。在350℃時，3種微膠囊的質量損失率分別為52%、58%和65%，其中SPI制備的微膠囊質量損失最少，熱穩定性最高。原因可能在于SPI在界面處有更好的吸附，形成的膜粘彈性更高，經噴霧干燥后形成的膠囊結構致密，高溫下水分蒸發后表面硬化，壁材的分解更難，所以熱穩定性更好[43]。第4階段為350～500℃，隨著溫度的升高，中間產物進一步完全裂解并碳化。在200℃以下，魚油微膠囊的質量損失很少，說明具有良好的熱穩定性，能滿足一般食品的加工條件。

3 結束語

以乳清分離蛋白、大豆分離蛋白和豌豆分離蛋白分別與麥芽糊精作為復合壁材，卵磷脂作為乳化劑，將微射流處理后的水包油乳液進行噴霧干燥以制備魚油微膠囊。對3種微膠囊的性能進行比較發現：乳液粒徑從大到小依次為SPI、PPI、WPI，乳化性質從優到劣依次為WPI、PPI、SPI；在3種微膠囊中，WPI為壁材的微膠囊包埋率最高、氧化穩定性最好；WPI制備的微膠囊微觀結構呈球形，表面較為完整，SPI和PPI制備的微膠囊表面存在凹陷和少量孔洞，導致包埋效果不好；WPI的α-螺旋和無序結構含量高，更有利于包埋；溫度在200℃以下，3種魚油微膠囊都具有良好的熱穩定性，能滿足一般食品的加工條件，其中SPI制備的微膠囊熱穩定性最高。因此，除熱穩定性外，用乳清分離蛋白制備魚油微膠囊性質要優于其他兩種蛋白。