空化微射流對米糠蛋白熱聚集體結構及特性的影響

周麟依 王 辰 王中江 劉 軍 李汝恒

(1.大理大學工程學院，大理 671000；2.東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030；3.臨邑禹王植物蛋白有限公司，臨邑 251500)

0 引言

蛋白質的功能性是指蛋白質在食品體系中表現出的物理化學性質的總稱[1]，主要分為4類：水化性質、界面性質、結構性質及感官性質。米糠蛋白(RBP)的主要功能性質為結構性質和界面性質。界面特性是蛋白質疏水性基團及親水性基團的作用結果，如乳化、起泡、成膜等。熱處理是蛋白制品加工中不可避免的操作單元，如熱殺菌、噴霧干燥等。蛋白質在熱殺菌、噴霧干燥等加工過程中，極易受到溫度的影響而發生構象改變(即高級結構發生去折疊)，分子內部疏水殘基逐漸暴露并且表面巰基含量增高，高離子強度下形成疏水鍵的氨基酸殘基在加熱作用下從蛋白分子內部轉移到分子表面，這些促使蛋白質通過化學作用力相互連接而逐漸聚集，組分的聚集程度決定了蛋白某些生物和功能特性，如蛋白的溶解性、乳化活性和乳化穩定性等[2-5]。文獻[6]研究發現，RBP乳化性受其表面的靜電作用及RBP疏水基團的暴露情況的影響；文獻[7]發現RBP的溶解性與吸附脂質的能力成正比，會直接影響油-水界面的形成，最終對RBP的乳化性質造成影響。近年來，國內外學者對蛋白熱誘導聚集領域進行了大量的研究，研究熱誘導聚集對蛋白功能性質的影響，進而探尋因熱聚集而引起功能衰減的解決方法[8]。

現有研究表明，空化微射流具有強烈剪切力、高速撞擊力、高壓瞬時釋放和空穴效應等，在很大程度上能改變蛋白的結構和性質，可以有效破壞分子間的疏水以及靜電相互作用，改變蛋白分子的三、四級結構，減小粒徑尺寸，提高蛋白聚集體的界面吸附穩定性及疏水作用，進而提高蛋白的乳化特性。目前，關于各種蛋白結構和功能特性的研究較多，文獻[9]探究了大米谷蛋白熱聚集行為對其結構和功能特性的影響，文獻[10]研究了棉籽球蛋白在熱處理下的聚集行為、聚集體結構及其對凝膠特性的影響，文獻[11-12]發現微射流處理可提高米谷蛋白和豌豆蛋白熱聚集體結構和功能特性，但并未見空化微射流處理對RBP熱聚集體結構和特性的影響研究。

本文采用加熱方法誘導RBP形成聚集體，利用空化微射流技術處理蛋白熱聚集體，探究空化微射流處理對聚集體結構特性(分子量分布、官能團、空間結構、粒徑、電位、疏水性)和乳化特性(乳化性和乳化穩定性)的影響。分析空化微射流處理壓強對RBP熱聚集體乳化特性的影響，研究空化微射流調控蛋白乳化特性的影響機制，為解決RBP在加工過程中因熱聚集造成的蛋白功能特性下降的難題提供方法和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RBP(純度90%)，西安博聯特化工有限公司；二硝基苯肼，天津博迪化工股份有限公司；三氯乙酸，天津市致遠化學試劑有限公司；疊氮化鈉，山東浩中化工有限公司；乙酸乙酯，天津市光復精細化工研究所；β-巰基乙醇，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；過硫酸銨，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；2-硝基苯甲酸(DTNB)，天津博迪化工有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)，天津博迪化工有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)，廣州奈姆塔貿易有限公司；8-苯胺萘磺-1-酸鹽(ANS)，上海將來實業股份有限公司；尿素(Urea)試劑，武漢博士康生物工程有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，索萊寶生物科技有限公司。其他試劑均為分析純等級。

1.2 儀器與設備

M-110EH型空化微射流均質機，美國MFIC公司；Asylum Research Cypher型原子力顯微鏡，牛津儀器科技(上海)有限公司；LW-1600FC型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；Zetasizer Nano ZSP型納米粒度電位儀，馬爾文儀器公司；F-4500型熒光分光光度計，日本HITACHI公司；MAGNA-IR560型傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力公司；Ultra-TurraxT25型高速分散器，德國IKA公司；ALPHA1-4LSC型冷凍干燥機，德國Christ公司；PHSJ-4A型實驗室pH計，上海雷磁公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；XW-80A型旋渦混合器，上海青浦滬西儀器廠；HH-6型數顯水浴鍋，山東愛博科技貿易有限公司。

1.3 RBP熱聚集體的制備

將米糠蛋白溶于0.01 mol/L pH值 7.4(含NaN3質量濃度0.5 mg/mL)的磷酸鹽緩沖溶液配成10 mg/mL的RBP溶液，將RBP溶液中置于100℃恒溫箱中20 min，誘導RBP發生熱聚集，迅速冰浴，冷卻備用。將熱聚集液體(TRBP)于空化微射流中在0、30、60、90、120 MPa壓力下處理5 min，之后轉移至低溫離心機中9 000 r/min離心20 min，留存上清液經過24 h冷凍干燥后，加上可溶性RBP即可得到6種蛋白樣品，記為SRBP、STRBP、STRBP-30MPa、STRBP-60MPa、STRBP-90MPa和STRBP-120MPa。

1.4 原子力顯微鏡(AFM)成像

參照文獻[13]的方法，并稍作修改。取2 μL樣品溶液(10 μg/mL)置于剛剝離的云母片上，室溫(20℃)干燥處理10 min后使用Asylum Research Cypher型原子力顯微鏡進行觀察。操作條件：頻率為320 kHz；掃描速度1.0 Hz；硅尖的長度為125 μm，力常數為42 N/m，針尖頂端曲率半徑8 nm，共振頻率為290 kHz，測試采用輕敲模式。以去離子水樣品作為空白樣品進行觀察，排除可能的底片污染。

1.5 指標測定

(1)粒徑分布

將樣品配成0.05 g/mL的溶液，攪拌均勻后，緩慢加入測量池中，當遮光度達到8%左右時停止加樣，用儀器測量其粒徑和電位。

(2)濁度

參照文獻[14]的方法，并稍作修改。將樣品溶于去離子水中配制成所需的濃度，在室溫下磁力攪拌60 min。分光光度計在600 nm下測定其吸光度。以去離子水作空白，測定其吸光度A，濁度計算公式為

(1)

式中A——稀釋乳液在600 nm處的吸光度

V——稀釋倍數

I——光程差，取0.01 m

(3)電位

采用Zetasizer Nano ZSP型粒度儀測定蛋白溶液的ζ-電位。測定條件如下：比色池的長度為1 cm，間距為0.4 cm。測定溫度25℃，溫度平衡時間2 min。

(4)表面疏水性

參照文獻[15]中ANS熒光探針法測定樣品表面疏水性的方法，并稍作修改。用0.1 mol/L的中性磷酸鹽緩沖溶液稀釋，10 000 r/min高速離心處理0.5 h除去沉淀物，以Lowery法分析測試上清液中蛋白濃度，通過磷酸鹽緩沖液的逐步稀釋，調控蛋白溶液質量濃度為0.05～0.4 mg/mL，取40 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液滴加至不同濃度的蛋白溶液4 mL，經振蕩混勻后靜置3 min，在熒光分光光度計下進行熒光強度測試，測試條件為激發波長λex=390 nm，發射波長λem=468 nm，掃描夾縫設置為5 nm，掃描速度設置為10 nm/s。將熒光強度與蛋白質量濃度作線性圖，以初始段的斜率表征樣品的表面疏水性。

(5)游離氨基含量

參照文獻[16]的方法，并稍作修改。400 mg OPA試劑充分溶解于1 mL甲醇溶液中，而后依次向溶液中加入預先配置的質量濃度為200 g/L的SDS溶液2.5 mL及濃度為0.1 mol/L的硼酸溶液25 mL，繼而轉移至通風櫥內加入100 μL的β-巰基乙醇，最后將溶液用蒸餾水定容至50 mL，制備成OPA溶液用于后續檢測分析，量取OPA試劑4 mL與200 μL蛋白樣品充分混勻后進行35℃水浴處理2 min，以蒸餾水空白組為對照在340 nm處測定吸光度。

(6)蛋白羰基含量

參照文獻[17]的方法，并稍作修改。將蛋白用去離子水配制為5 mg/mL的蛋白溶液，以雙縮脲指示劑法測定蛋白質溶液的質量濃度(y=0.241 2x+0.013 5,R2=0.997)。在367 nm處用2,4-二硝基苯肼比色法測吸光度A367，每毫克蛋白質羰基衍生物的摩爾數通過消光系數22 000 L/(mol·cm)進行計算，羰基含量計算公式為

(2)

式中E——蛋白羰基質量摩爾濃度，nmol/mg

n——稀釋因子

C——蛋白質溶液質量濃度，mg/mL

(7)蛋白游離巰基和二硫鍵含量

參照文獻[18]的方法，并稍作修改。稱取400 mg的DTNB，加入Tris-Gly緩沖液定容至100 mL，配成Ellman試劑。分別稱取2 mg樣品溶解于2 mL的Tris-Gly緩沖液(pH值8.0)和0.02 mL的Ellman試劑。測定時溶液振蕩快速混合后在25℃下保溫反應15 min，用分光光度計測定其在412 nm處的吸光度，以不加Ellman試劑為空白，測量游離巰基含量。將樣品用磷酸鹽緩沖液配置成0.5 mL質量濃度為5 mg/mL的蛋白質溶液，置于10 mL塑料離心管中，加入2.5 mL含8 mol/L尿素的Tris-Gly(10.4 g Tris, 6.9 g Gly，每升加1.2 g EDTA，pH值8.0)，每隔1.5 min加入20 μL DTNB(0.004 g DTNB用Tris-Gly溶解定容1 mL，避光)，反應25 min，立即在412 nm處測得吸光度A412，測出總巰基含量。二硫鍵含量為總巰基含量和游離巰基含量差的1/2。對照組不加蛋白質溶液，其他處理方法相同。根據標準曲線(y=0.050 2x-0.000 9，R2=0.999 4)計算出蛋白質質量濃度ρ。使用摩爾消光系數13 600 L/(mol·cm)，巰基含量計算公式為

(3)

(4)

式中F——巰基質量摩爾濃度，μmol/g

L——二硫鍵質量摩爾濃度，μmol/g

D——稀釋系數

C1——樣品蛋白總巰基質量摩爾濃度，μmol/g

C2——樣品蛋白游離巰基質量摩爾濃度，μmol/g

(8)紅外光譜分析

參照文獻[19]的方法，并稍作修改。將凍干樣品置于干燥器內充分干燥，稱取1 mg樣品于100 mg溴化鉀中混勻，在瑪瑙研堝中研磨并用壓片器壓片，于紅外光譜儀中測定吸收光譜。測量條件：波數范圍為4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，波數精度0.01 cm-1，掃描次數64次，環境溫度25℃。

(9)內源性光譜分析

參照文獻[20]的方法，并稍作修改。稱取一定量樣品于5 mmol磷酸緩沖液(pH值7.0)配成質量濃度0.001 g/mL的溶液，取適量樣品置于熒光分光光度計中測量。測量條件：激發波長為290 nm，發射波長范圍為300～400 nm，狹縫寬均為5 nm，電壓為700 mV。

圖1 原子力顯微鏡圖

(10)乳化性和乳化穩定性

參照文獻[21]的方法，并稍作修改，采用比濁法測定乳化特性。在測試管中分別加入15 mL質量濃度0.001 g/mL蛋白質溶液和5 mL葵花籽油，乳液經高速均質機(24 000 r/min)處理2 min后，從測試管底部取出50 μL乳液，用質量濃度0.001 g/mL的SDS溶液稀釋100倍后，于500 nm比色。乳化性指數和乳化穩定性指數的計算公式為

(5)

(6)

式中H——乳化性指數，m2/g

G——乳化穩定性指數，min

A0——0 min時的吸光度

A30——30 min時的吸光度

φ——光程，取0.01 m

θ——油相質量分數，取25%

1.6 數據處理和分析

每個實驗均進行3次重復平行實驗，利用SPSS Statistics 22軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析，P<0.05為顯著性差異。采用Origin 9.1軟件、PeakFit 4.12軟件進行數據分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 空化微射流對RBP熱聚集體表面結構的影響

原子力顯微鏡通過檢測待測樣品表面和一個微型力敏感元件之間的極微弱原子間相互作用力來研究物質的表面結構及性質。從深色到淺色的色澤漸變過程即為蛋白從下到上的高度狀態過程，深色表征蛋白顆粒高度較低，淺色表明顆粒高度較高。由圖1可知，RBP呈分散狀態，顆粒大小差異較大，表面凸起平緩，直徑多在20～40 nm之間，最高高度為44.5 nm，經過熱誘導聚集后直徑多在20～150 nm，顆粒狀態相互連接，淺色顆粒較多，最高高度為158 nm。熱聚集體經過空化微射流處理后，蛋白顆粒粒徑隨著壓力的增大而呈現先減小后增大趨勢，當壓力為90 MPa時顆粒最小，最高高度為56.2 nm，顆粒狀態整體一致且呈現分散態。結果表明，熱誘導聚集不僅增大了蛋白粒徑，還使蛋白從分散態成為交聯態，且熱聚集體在經過低壓處理后(<90 MPa)，觀察到SRBP的顆粒高度從158 nm降到56.2 nm。在處理壓力范圍為90～120 MPa時，觀察到顆粒高度為56.2～90.7 nm。該研究結果直觀反映了壓力對熱聚集體高度和整體表面結構的影響，表征了蛋白的3D結構變化，為蛋白分析提供了宏觀影像。

2.2 空化微射流對RBP熱聚集體粒徑的影響

由圖2粒徑分布和表1中平均粒徑可知，與SRBP相比，熱聚集體平均粒徑、PDI(蛋白質分散指數)和濁度分別升高了373.47 nm、0.06和347.11。STRBP的粒徑分布圖出現3個峰，顆粒大小明顯增大且分布極不均勻，PDI、電位絕對值和濁度增大；而隨著處理壓力的增大，粒徑分布峰圖微微左移，且蛋白分子分布集中，平均粒徑、PDI、電位絕對值和濁度減小，當處理壓力超過90 MPa時，粒徑分布圖右移，蛋白平均粒徑、PDI和濁度增大。受熱后蛋白質構象去折疊，分子內部疏水殘基和帶電粒子暴露，蛋白質分子通過非共價相互作用發生聚集，導致顆粒的粒徑、濁度和PDI也隨之增大[2-3]。空化微射流處理產生的強剪切力可改變蛋白分子的三、四級結構，暴露分子間疏水性基團，增大蛋白間疏水相互作用，且壓力越大其作用效果越明顯[22-24]，增加蛋白質表面的負電荷數量，增強顆粒間的靜電排斥力[25]，最終提高蛋白質分散體系的穩定性。但當處理壓力為90 MPa時，疏水性基團的暴露量趨于臨界值，當處理壓力持續增大，疏水性基團含量進一步增大，在更多的疏水性基團發生暴露時，蛋白質表面的極性氨基酸尤其是帶電氨基酸相對減少[25]，而疏水相互作用的增大，促進了聚集體再次聚集，進而促使蛋白顆粒發生聚集，消耗溶液中的負電荷，從而使得ζ-電位下降[26]，并促進平均粒徑、濁度和PDI增大。

圖2 蛋白聚集體粒徑分布圖

表1 不同處理方式下蛋白顆粒的特性

注：同列中相同字母表示數據差異不顯著(P>0.05)，不同則差異顯著(P<0.05)，下同。

2.3 空化微射流對RBP熱聚集體表面疏水性的影響

表面疏水性不僅反映了RBP的結構變化[27]，也對穩定蛋白質結構、提高蛋白質功能有重要作用[28]。如圖3(圖中不同字母表示差異顯著)所示，與SRBP相比，熱聚集體表面疏水性指數提高了245.1。隨著處理壓力的增大，蛋白質表面疏水性呈現先增大后減小的趨勢，且在處理壓力為90 MPa時達到最大。熱處理暴露了被掩蔽在蛋白質天然結構內的疏水結構域，增大蛋白質的表面疏水性，降低了顆粒間靜電斥力[29]，蛋白質發生聚集時結合位點的改變導致部分疏水性基團暴露，表面疏水性增大。而空化微射流處理可以改變蛋白質的構象，低壓打開蛋白質聚集結構，增加蛋白質表面的負電荷數量，增強顆粒間的靜電排斥力，提高蛋白質的穩定性[30]。當處理壓力為90 MPa，表面疏水性和溶液穩態達到臨界值，表面疏水性指數提高了798.05，隨著處理壓力的進一步增大，微射流破壞蛋白質分子中的疏水結構域[12]，打破靜電斥力與疏水相互作用間的平衡，蛋白質分子之間重排，進而誘導新蛋白質聚集體的形成，表面疏水性減小。

圖3 蛋白質熱聚集體表面疏水性指數

2.4 游離氨基和羰基測定

游離氨基和羰基的含量變化在一定程度上可反映出蛋白質的氧化聚集程度。與SRBP相比，STRBP的游離氨基質量摩爾濃度降低了0.08 μmol/mg，而羰基質量摩爾濃度增加0.21 nmol/mg，如表2所示。隨著處理壓力的增大，與STRBP相比，蛋白游離氨基含量呈現先增大后減小趨勢，而羰基含量則呈現先減小后增大趨勢，且在90 MPa時氨基質量摩爾濃度提高了0.17 μmol/mg，羰基質量摩爾濃度降低了0.17 nmol/mg。研究表明，隨著溫度的升高，包含在分子內部的氨基酸側鏈暴露并被氧化生成羰基。而本實驗中氨基含量的增多和羰基含量的減少可能與空化微射流處理產生的強烈剪切力、高速撞擊力和高壓瞬時釋放導致蛋白結構打開和羰基鍵被破壞有關，這與文獻[31]一致。隨著處理壓力的進一步增大，高壓力差促使蛋白產生自由基促進羰基的形成，羰基含量逐漸增多[32]。

表2 氨基和羰基含量

2.5 空化微射流對RBP熱聚集巰基和二硫鍵的影響

巰基和二硫鍵是穩定蛋白質分子構象的重要化學鍵。如圖4(圖中同種圖例不同字母表示差異顯著，下同)所示，與SRBP相比，STRBP的總巰基和二硫鍵含量升高，而游離巰基含量減少。隨著處理壓強的增大，蛋白二硫鍵含量呈現先減小后稍增大的趨勢，而游離巰基則呈現先增大后減小的趨勢，且在60 MPa時游離巰基含量出現最大值，二硫鍵含量出現最小值。研究表明，在熱處理期間發生熱誘導的蛋白質去折疊將暴露最初埋在蛋白質內的SH基團，并將在蛋白質分子內引起SH/SS交換，導致二硫鍵含量增加，游離巰基含量減少[12]。而空化微射流處理打破蛋白質熱聚集狀態，破壞蛋白質的三、四級結構，將SS轉化為SH，SS含量減小，巰基含量增多。但當處理的壓力超過90 MPa時，蛋白進一步解折疊，隱藏的巰基暴露并被重新氧化形成二硫鍵[11]，在蛋白簇內部建立新的穩定結構，這與之前的研究結果一致。

圖4 蛋白聚集體巰基含量

2.6 RBP熱聚集體二級結構的測定

通過對紅外光譜圖進行擬合得到蛋白二級結構組成如表3所示，與SRBP相比，STRBP的β1結構相對含量提高了3.37個百分點，反平行β-折疊結構(β1+β2)相對含量提高了3.76個百分點，α-螺旋結構和β-轉角結構減少；經過空化微射流處理后，STRBP的β-折疊結構進一步轉化為β-轉角和α-螺旋結構，β-折疊結構含量減少，β-轉角、α-螺旋和無規卷曲結構含量增加，且在90 MPa β1折疊結構達到最小值。隨著處理壓力增大，β-折疊結構增多，α-螺旋、β-轉角和γ-無規則卷曲結構減少。熱誘導作用可使蛋白α-螺旋展開[30]，誘導α-螺旋結構減少，增大溶液表面疏水性，進而促進蛋白聚集，而β1-折疊結構在聚集分子中形成[33]，因此STRBP的α-螺旋結構減少，β1-折疊結構增多。空化微射流的高剪切力將不溶性聚集體轉化成可溶性聚集體[34]，當處理壓力增大，β-折疊結構主要轉化為β-轉角和非天然α-螺旋結構[11]，β-折疊結構減少，β-轉角和α-螺旋結構增多。β-轉角結構是蛋白質高度有序結構的產物[35]，伴有更強的分子內部氫鍵，β-轉角結構的增多可改善蛋白的功能性質。隨著處理壓強的進一步增大(超過90 MPa)，破壞了蛋白分子中的疏水結構域[12]，打破靜電斥力與疏水相互作用之間的平衡，蛋白分子重排和新聚集體的形成導致β1-折疊結構增多，α-螺旋、β-轉角和γ-無規則卷曲結構減少。

表3 二級結構各組分相對含量

2.7 蛋白熱聚集體三級結構的測定

蛋白熒光光譜主要反映的是色氨酸微環境極性的變化，可表征蛋白結構的三級結構構象變化。由圖5可知，與SRBP相比，STRBP的處理壓力從0 MPa至120 MPa的最大吸收波長λmax均發生了不同程度的藍移；與STRBP相比，STRBP-30MPa和STRBP-60MPa的λmax發生了紅移，STRBP-90MPa和STRBP-120MPa的λmax無變化。研究表明，經熱處理后的蛋白在共價鍵或非共價鍵相互作用下發生聚集，色氨酸和酪氨酸發色基團被重新掩埋，形成具有更高分子量的寡聚體或多聚體，λmax發生藍移。經過空化微射流處理后，隨著處理壓力的增大，蛋白發生解折疊作用使RBP可溶性蛋白熱聚集體打開，促使發色基團暴露，λmax發生紅移。當處理壓力進一步增大(超過90 MPa)，增大了蛋白顆粒發生相互碰撞的幾率，改變了蛋白分子的三、四級結構，有效破壞分子間的疏水以及靜電相互作用，誘發蛋白顆粒發生聚集，λmax藍移[22-24]。

圖5 蛋白熱聚集體熒光光譜

2.8 空化微射流對RBP熱聚集體乳化性的影響

蛋白質的乳化特性可通過乳化性和乳化穩定性來表征[29]。如圖6所示，與SRBP相比，STRBP的乳化性指數和乳化穩定性指數分別降低了77.61 m2/g和157.64 min。與STRBP相比，熱聚集體隨著處理壓力的增大，其乳化性和乳化穩定性呈先增大后減小的趨勢，且在處理壓力為60 MPa時乳化性達到最大，處理壓力為90 MPa時乳化穩定性最大。熱誘導下，疏水基團的暴露促使蛋白質分子相互靠近并形成分子量較大的蛋白進而降低蛋白的乳化特性[36]。而空化微射流處理(30～90 MPa)可使蛋白熱聚集體解聚為更小的顆粒[37]，維持蛋白空間結構的非共價鍵作用力被破壞，蛋白質內部的疏水基團暴露，蛋白質能更快地吸附在油-水界面上，降低乳液的界面張力，進而提高蛋白的乳化性和乳化穩定性[38]。當處理壓力為90 MPa，乳化性指數和乳化穩定性指數提高了90.32 m2/g和281.68 min。而隨著處理壓力(120 MPa)的進一步增大，強大的剪切力使過度展開的蛋白質分子通過疏水相互作用形成聚集體，進而使蛋白粒徑增大，從而導致蛋白乳化性和乳化穩定性下降。

圖6 蛋白熱聚集體乳化特性

3 結束語

熱聚集體可改變RBP結構，將整體結構由分散態變成交聯態。與原蛋白相比，熱聚集體蛋白平均粒徑、PDI和濁度分別升高了373.47 nm、0.06和347.11，官能團如游離氨基質量摩爾濃度降低了0.08 μmol/mg，羰基質量摩爾濃度增加0.21 nmol/mg，二級結構中β1結構相對含量提高了3.37個百分點，β-折疊結構提高了3.76個百分點。α-螺旋結構、β-轉角結構和γ-無規則卷曲結構減少，表面疏水性指數提高了245.1，乳化性指數和乳化穩定性指數分別降低了77.61 m2/g和157.64 min。熱聚集體經過空化微射流處理后，其乳化特性明顯改善，平均粒徑、PDI和濁度明顯提高，90 MPa時氨基質量摩爾濃度提高0.081 μmol/mg，羰基質量摩爾濃度降低了0.17 nmol/mg，β1結構、α-螺旋結構與γ-無規則卷曲結構減少，表面疏水性、乳化性和乳化穩定性也顯著提高。