鎘脅迫下菊苣葉片原位高光譜響應特征與定量監(jiān)測研究

李嵐?jié)?申鳳敏 馬文連 樊 婕 李亞蓉 柳海濤

(河南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，鄭州 450002)

0 引言

鎘(Cadmium，Cd)是作物非必需、但毒性最強的重金屬元素之一，具有很高的潛在污染風險和較強的水溶性，極易通過作物吸收而進入人體，不僅影響環(huán)境安全，同時也會危害人類健康[1-3]。因此，快速和精準識別作物鎘脅迫程度及范圍，對于降低和控制鎘污染、制定安全有效防控措施具有重要意義[4]。目前，傳統(tǒng)的作物鎘脅迫監(jiān)測主要以田間樣品采集、實驗室測試化驗為主，該方法雖然可以獲得較為準確的結果，但在分析過程中存在工作量大、操作繁瑣、周期長和成本高等問題，監(jiān)測結果具有一定的滯后性，限制了其發(fā)展應用[5-6]。近年來，隨著高光譜遙感技術的發(fā)展，利用鎘脅迫作物與正常生長作物在光譜維上的差異性開展無損、高效和原位監(jiān)測成為一種可能，并得以快速應用和發(fā)展。

當作物受到鎘脅迫時，宏觀上易造成植物葉片枯萎變黃，新生葉生長緩慢，植株長勢瘦弱，生物量、葉面積與光合色素等指標顯著降低；微觀上則表現(xiàn)出葉片變薄，細胞滲透壓降低，生理代謝紊亂，葉肉海綿組織和柵欄組織排列緊密，胞間隙減小等[5,7-8]。上述癥狀均會明顯影響葉片對光的吸收與反射性能，改變光在植物體內反射與折射路徑，繼而產(chǎn)生不同的光譜反射率，形成反射率不同的光譜曲線，并且上述特征波長光譜反射率變化對鎘脅迫程度的響應十分敏感，這也是利用葉片原位高光譜開展作物鎘脅迫定量監(jiān)測的營養(yǎng)及生理生化基礎[9]。

目前，高光譜技術已廣泛應用于作物重金屬脅迫監(jiān)測方面。關麗等[10]通過分析鎘脅迫水稻生理生化參數(shù)(色素、水分、LAI、鎘濃度等)與高光譜響應特征間定量關系，確立了鎘脅迫診斷的植被指數(shù)和定量監(jiān)測模型。RATHOD等[11]研究認為，不同鎘脅迫下大麥葉片高光譜反射率具有明顯的差異性，利用葉片原位高光譜技術可實現(xiàn)作物鎘質量分數(shù)的精準監(jiān)測。ABDEL-RAHMAN等[12]利用偏最小二乘回歸模型(PLS)定量監(jiān)測了瑞士甜菜葉片鎘含量，獲得了較好的預測效果。另有一些研究通過分析鎘脅迫下作物葉綠素、水分等生理生化指標變化，并量化其與高光譜間關系，從側面驗證高光譜技術在作物鎘脅迫監(jiān)測上的適宜性及可行性[3, 13-14]。分析發(fā)現(xiàn)，已有利用高光譜技術開展作物鎘脅迫的監(jiān)測研究大都集中于構建植被指數(shù)、生化指標反演和明晰光譜響應關系等，且主要以糧食和經(jīng)濟作物為主，而系統(tǒng)探究不同鎘脅迫下菊苣葉片原位高光譜變化規(guī)律，篩選能穩(wěn)定指示葉片鎘質量比變化有效波段，并構建定量監(jiān)測模型的研究仍相對較少。基于此，本文以菊科菊苣屬一年或多年生草本植物、具有多種用途(可作為高檔蔬菜、新型優(yōu)質牧草、香料和藥材等)并對重金屬具有較強吸收特性的菊苣為供試材料，通過設置不同品種及鎘濃度脅迫水培實驗，探究其與葉片原位高光譜間定量關系，篩選能穩(wěn)定指示鎘濃度變化的有效波段，并構建高魯棒性的監(jiān)測模型，以期為作物鎘脅迫的早期快速、無損和原位監(jiān)測提供實驗參考和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菊苣(CichoriumintybusL.)品種分別為“歐洲菊苣”、“美洲菊苣”和“黔育一號”，其中，“歐洲菊苣”與“美洲菊苣”購自北京百綠種業(yè)有限公司，“黔育一號”由貴州省草業(yè)研究所提供，均為市場上常見和廣泛種植的代表品種。菊苣培養(yǎng)營養(yǎng)液采用Hoagland’s營養(yǎng)液[15]。

1.2 實驗設計

水培實驗于2018年12月至2019年3月在河南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院水培實驗室進行。選取籽粒飽滿、大小均一的上述3個品種菊苣種子，先后分別用15% H2O2浸泡15 min，再用蒸餾水完全洗凈后放入30℃左右的溫水中浸泡20 min，而后均勻放入裝有少量水的專用育苗盤內，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)72 h后轉入人工氣候室。待菊苣長到兩葉一心時，選取長勢一致的菊苣幼苗移到1/8 Hoagland’s營養(yǎng)液的黑色塑料盒中(25 cm×17 cm×8 cm)進行培養(yǎng)。塑料盒上蓋有帶均勻小圓孔的黑色泡沫塑料板，將菊苣幼苗用海綿固定于小圓孔內。每間隔3 d，隨菊苣幼苗長勢增大，逐步將營養(yǎng)液濃度調整為1/4、1/2和全量Hoagland’s濃度。水培試驗均在人工氣候室進行，晝夜時間16 h/8 h，晝夜溫度為25℃/20℃，相對濕度為60%～70%。

菊苣幼苗在營養(yǎng)液中生長12 d后，開始澆灌添加不同濃度鎘(0、5、10、25、50、100、200 μmol/L，鎘以CdCl2形式添加)的Hoagland’s完全培養(yǎng)液，使鎘脅迫程度為低(5、10 μmol/L)、中(25、50 μmol/L)、高(100 μmol/L)和嚴重(200 μmol/L)4個等級。每3 d更換一次營養(yǎng)液，同時控制營養(yǎng)液的pH值在6.0左右(圖1)。每個處理5個重復，共計105盆。此外，于菊苣生長期間每2 d隨機調整水培盒的位置，降低實驗誤差。

圖1 不同鎘脅迫下菊苣生長照片

1.3 測定指標與方法

1.3.1菊苣葉片原位高光譜

分別于菊苣六葉期(2019年1月20日)和十葉期(2019年2月3日)，采用美國ASD(Analytical spectral devices)公司生產(chǎn)的FieldSpec Pro FR型便攜式高光譜儀，沿菊苣主莖自上而下，測定不同鎘濃度脅迫下第4片完全展開葉中部葉片光譜反射率。該儀器測量波段范圍為350～2 500 nm，350～1 000 nm光譜分辨率與采樣間隔分別為3 nm和1.4 nm，1 000～2 500 nm分別為10 nm和2 nm。測試時，利用光譜儀自帶葉片夾將葉片夾持固定，采用光譜探頭測定葉片光譜反射率。每個重復測試4株葉片光譜，每株采集10條光譜曲線，將4株葉片光譜數(shù)據(jù)取平均后作為該重復的葉片光譜反射率。為提高光譜監(jiān)測精度，增強光譜信噪比，綜合兩次光譜測試結果，刪除350～400 nm和2 400～2 500 nm受噪聲影響較大的波段，剔除后共有2 001個有效波段數(shù)據(jù)。

1.3.2菊苣葉片鎘質量比

上述葉片光譜測試結束后，將菊苣葉片從水培盒中取出并依次用自來水和高純水洗滌、擦凈，剪除根部。而后將葉片置于105℃干燥箱中殺青30 min，70℃干燥至質量恒定。用剪刀將樣品剪碎，稱取0.20 g置于消煮管中，采用HNO3-HClO4(體積比3∶1)消化法制備待測液，原子吸收分光光度計(AAS，ZEEnit70d0，Analytikjena，德國)測定葉片鎘質量比(mg/kg)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1建模集與驗證集劃分

綜合分析菊苣品種的代表性及穩(wěn)定性，同時考慮到數(shù)據(jù)變化范圍與模型構建的穩(wěn)定性和普適性，將本實驗所獲取210個樣本數(shù)(3個菊苣品種、7個鎘脅迫處理、5次重復和2次生育期數(shù)據(jù)采集)按2∶1劃分為建模集和驗證集兩部分，計算分析兩數(shù)集平均值、標準差(SD)和變異系數(shù)(CV，%)。其中，“歐洲菊苣”和“黔育一號”兩品種實驗所采集數(shù)據(jù)用于構建光譜監(jiān)測模型(n=140)，“美洲菊苣”實驗數(shù)據(jù)則為驗證集(n=70)。

此外，為進一步驗證上述所構建模型的魯棒性，明確鎘脅迫下菊苣葉片光譜響應特征及建立精準度較高的光譜監(jiān)測模型。在上述實驗基礎上，采用同樣水培裝置及方法，于2019年3月再次布置9個菊苣品種獨立驗證實驗(普那、歐洲、美洲、黔育一號、將軍、香檳、益豐、闊葉和奧利維亞菊苣)，鎘脅迫濃度設為50 μmol/L，5次重復，分別于六葉期和十葉期沿菊苣主莖自上而下測試第4片完全展開葉片光譜反射率和鎘質量比，以檢驗前期所構建模型的準確性能(n=90)。

1.4.2一階微分光譜變換

對原始光譜(R)進行變換是降低環(huán)境噪聲干擾，提高光譜信噪比和光譜監(jiān)測精度的有效措施。一階微分(First derivative reflectance, FDR)光譜是目前應用十分廣泛且行之有效的光譜變換方法。研究表明，作物葉片原始光譜(R)經(jīng)FDR變換后可有效降低基線或其它環(huán)境背景干擾，弱化混合重疊峰，增強特征波段信息強度與分辨率，提高光譜診斷靈敏度[16]。此外，F(xiàn)DR光譜還可有效消除部分線性或接近線性的噪聲光譜對目標光譜的影響，提高光譜監(jiān)測識別度，其反射率計算公式為[17]

(1)

式中λi——波段i波長，nm

R′(λi)——一階微分光譜反射率

Δλ——波長λi+3到λi-2的間隔

本實驗利用Matlab R2012a軟件對所獲取菊苣葉片原始光譜(R)進行FDR變換，光譜間隔設置為5。

1.4.3模型構建與應用

為有效分析菊苣葉片鎘質量比與其原位高光譜反射率間定量關系，明確不同鎘濃度脅迫下光譜響應特征并構建定量監(jiān)測模型，本研究首先以菊苣葉片原始光譜(R)和FDR光譜為自變量，以鎘質量比為因變量，分別采用逐步回歸(Stepwise regression，SWR)、主成分回歸(Principal component regression，PCR)和偏最小二乘回歸(Partial least square，PLS)統(tǒng)計方法研究兩者間關系，確定最佳監(jiān)測模型。

SWR分析目前應用較多并可有效解決自變量間存在的多重共線性問題，其公式為

Yi=β1+β2X2i+β3X3i+…+βnXni

(2)

式中β1，β2，…，βn為回歸系數(shù)；X2i，X3i，…，Xni為回歸分析自變量。SWR主要思想是對每個逐步引入的自變量進行F檢驗，并對已引入自變量進行t檢驗，當已引入自變量由于新變量的引入而變得不顯著時，則將引入變量剔除。

PCR分析則從海量高光譜數(shù)據(jù)中尋求對應變量影響較大的主控因子并構建定量回歸方程，回歸方程公式同SWR。主成分分析中，首先將原始數(shù)據(jù)標準化并計算相關系數(shù)矩陣；其后求取相關矩陣的特征根、特征向量和方差貢獻率，確定主成分數(shù)；而后使用主成分替代原始變量再次進行多元回歸，公式為Yk=α1+α2X2k+α3X3k+…+αnXnk；最后將原始變量代入建立主成分回歸模型并進行系統(tǒng)分析。

PLS分析是一種新型的多元統(tǒng)計分析方法，可以有效處理自變量個數(shù)(波段數(shù))遠大于因變量(如鎘質量比)且自變量間具有高度多重共線性的高光譜數(shù)據(jù)。PLS集典型相關分析、主成分分析和多元線性回歸分析為一體，不僅可以降低光譜分析維數(shù)，同時又可從高維光譜數(shù)據(jù)中找到影響因變量(鎘質量比)的主控因子，使所構建模型具有更高的魯棒性。

模型預測精準性采用實測值與預測值間決定系數(shù)(R2)、均方根誤差(RMSE)和相對分析誤差(RPD)來表征。其中，R2表示模型擬合度，其值越高模型越穩(wěn)定；RMSE表示模型精確度，值越小則模型預測能力越高；RPD則是表征光譜監(jiān)測模型通用性高低的關鍵指標，RPD小于1.4表示模型不可用，RPD為1.4～2.0可用，RPD大于2.0則表示模型精準度較高，通用性能好[18]。

1.4.4有效波段選取與應用

在確定最佳光譜監(jiān)測模型基礎上，從海量高維高光譜數(shù)據(jù)中篩選出能有效表征菊苣葉片鎘質量比時空變化特征的有效波段或重要波段，對降低光譜分析維度，增強光譜監(jiān)測時效性和準確度均具有重要意義。本文利用PLS分析模型中的無量綱評估指標：變量重要性投影值(Variable important in projection，VIP)從全波段(400～2 400 nm)光譜范圍內優(yōu)選出菊苣葉片鎘質量比的有效波段。VIP值可定量、快速和直觀地反映出各個波段在預測因變量時的重要程度，其臨界值為1.0，VIP越高，表示該波段預測性能越強。此外，在確定有效波段時還應遵循以下2個原則：所篩選有效波段應符合作物光譜營養(yǎng)學監(jiān)測基本原理，即鎘脅迫影響菊苣葉片物質和結構等生理生化指標變化，繼而影響光譜吸收與反射性能；基于有效波段構建的監(jiān)測模型與全波段反演模型相比其精準度不應差別過大。

同時，為深入評估所確定有效波段的魯棒性及普適性，首先利用驗證集數(shù)據(jù)對基于有效波段構建的模型進行精準度檢驗，同時采用9個品種獨立實驗數(shù)據(jù)進行再驗證，并繪制1∶1比例圖。

利用Excel 2007進行基礎數(shù)據(jù)輸入和分析；Matlab R2012a軟件將所測葉片光譜數(shù)據(jù)進行預處理并進行模型的定量評估與有效波段選擇(SWR、PCR和PLS)；采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫對苗期菊苣葉片鎘質量比的影響

不同生育期菊苣葉片鎘質量比隨鎘脅迫程度增加而迅速提高，該結果在3個品種間變化趨勢相一致，表明外源鎘的添加可顯著影響菊苣對鎘的吸收與積累特性(圖2，圖中同一生長期的不同字母表示各質量比間差異顯著)。對于建模集數(shù)據(jù)，其葉片鎘質量比變化范圍為15.6～1 802.7 mg/kg，平均值、標準差和變異系數(shù)分別為437.2 mg/kg、460.7 mg/kg和105.4%，驗證集數(shù)據(jù)上述4個指標分別為18.4～1 702.5 mg/kg、476.9 mg/kg、536.1 mg/kg和112.4%。該結果顯示本實驗驗證集菊苣葉片鎘質量比數(shù)據(jù)變幅均位于建模集內，且無論建模集亦或驗證集，其變異系數(shù)均大于100%，表明兩數(shù)集均具有較高的離散度和變異性，其所表征的菊苣鎘質量比具有較高的指示范圍，可反映目前條件下菊苣葉片鎘質量比的整體變幅。因此，本實驗將“歐洲菊苣”和“黔育一號”數(shù)據(jù)用于模型構建“美洲菊苣”作為獨立實驗驗證集具有較高的可行性和普適性，為構建高穩(wěn)定性的光譜監(jiān)測模型奠定了良好基礎。此外，變異系數(shù)高于100%則說明本實驗所采集數(shù)據(jù)具有強烈的變異性、數(shù)據(jù)代表性和覆蓋能力，同時也顯示菊苣對鎘具有很高的吸收與富集能力，為篩選對鎘響應敏感并具有高吸收與高積累特性的“新物種”和基于葉片原位高光譜技術實現(xiàn)快速、無損監(jiān)測提供了參考。

圖2 不同鎘脅迫下苗期菊苣葉片鎘質量分數(shù)動態(tài)變化

2.2 鎘脅迫對苗期菊苣葉片高光譜變化的影響及其與鎘質量比相關性分析

以建模集數(shù)據(jù)分析為例，闡釋鎘脅迫對菊苣葉片原位高光譜反射率變化特性的影響(圖3a、3b)及其與葉片鎘質量比間定量相關關系(圖3c、3d)。結果表明，不同鎘濃度脅迫下菊苣葉片光譜反射率具有明顯的綠色植被光譜特征，即400～600 nm具有中等反射值，反射率在0.05～0.15之間；550 nm附近呈現(xiàn)葉綠素強吸收峰，680 nm附近具有一個較低的反射谷；800～1 300 nm進入一個平臺期，反射率高達0.50～0.60；1 300～2 500 nm則是水分的強吸收區(qū)，反射率變幅較大，為0.05～0.25(圖3a、3b)。可見光區(qū)(400～715 nm)，隨鎘脅迫程度增加，葉片光譜反射率呈下降趨勢；近紅外區(qū)(715～1 300 nm)低鎘濃度脅迫時(0～5 μmol/L)葉片反射率相對較高，中高脅迫(10～100 μmol/l)反射率雖有差異但相對集中，嚴重脅迫時(200 μmol/L)葉片反射率則最低；中紅外區(qū)(1 300～2 400 nm)不同鎘濃度脅迫間葉片光譜反射率未表現(xiàn)出較為一致性變化規(guī)律。

此后，采用相關性分析的方法將建模集全波段(400～2 400 nm)原始光譜(R)和FDR光譜反射率與葉片鎘質量比進行定量相關分析(n=140)并繪制決定系數(shù)曲線(R2)(圖3c、3d)。結果發(fā)現(xiàn)，對于原始光譜(R)，不同波段范圍間其決定系數(shù)變異較大，可見光區(qū)平均決定系數(shù)為0.286，達99%顯著性水平，最大值為0.347，位于670 nm紅光附近。此外，紅(640～715 nm)、橙(640～610 nm)、黃(610～530 nm)、綠(505～525 nm)、藍(505～470 nm)和紫(470～400 nm)光區(qū)平均決定系數(shù)分別為0.293、0.301、0.229、0.308、0.335和0.307。近紅外區(qū)決定系數(shù)則進入一個平臺期，平均決定系數(shù)為0.548，波段間差異不大；中紅外區(qū)決定系數(shù)則呈現(xiàn)跳躍式變化特征，平均值為0.137，相對較低。相比于原始光譜(R)，F(xiàn)DR光譜與葉片鎘質量比間相關性整體具有較大的提高，但不同波段范圍間差異較大，跳躍性則更為顯著，分別在717、954、1 026、1 091、1 291、1 629、1 750 nm處出現(xiàn)峰值。該結果為后續(xù)篩選能穩(wěn)定反映葉片鎘質量比變化特征的有效波段提供了較好的數(shù)據(jù)支撐。

圖3 不同鎘脅迫下菊苣葉片原位高光譜反射率變化特征及其與鎘質量比相關性分析

2.3 基于葉片原位高光譜的鎘質量比光譜監(jiān)測模型構建

為進一步探究菊苣葉片高光譜與其鎘濃度間定量回歸關系，構建定量反演模型，實現(xiàn)光譜監(jiān)測的定量化。在相關性分析基礎上，以葉片原始光譜(R)和FDR光譜為自變量，鎘濃度為因變量，分別采用逐步回歸(SWR)、主成分回歸(PCR)和偏最小二乘回歸(PLS)的整體光譜分析技術定量表征兩者間關系(表1)。結果表明，與葉片原始光譜(R)光譜相比，對光譜進行一階微分變換后(FDR)對葉片鎘質量比預測性能明顯提高。對于建模集，SWR、PCR和PLS 3種模型采用光譜(R)的RPD分別為2.51、3.45和4.03，雖然預測性能均較理想，但與FDR光譜相比，RPD值仍分別降低23.7%、6.8%和63.2%；驗證集原始光譜(R)采用SWR模型RPD僅為0.82，穩(wěn)定性較差，PCR和PLS的RPD也僅在2.0左右，與FDR 3種光譜預測模型RPD值的1.66、2.54和2.96相比，表現(xiàn)出較大的差異性。不同光譜預測模型間，無論原始光譜(R)亦或FDR光譜，建模集亦或驗證集，其變化趨勢均由小到大表現(xiàn)為SWR、PCR、PLS，如對于FDR-PLS菊苣葉片鎘質量比光譜監(jiān)測模型，建模集和驗證集決定系數(shù)(R2)分別高達0.99、0.92，相對分析誤差(RPD)則分別為10.95、2.96。綜上，本文采用基于FDR-PLS的光譜定量監(jiān)測模型來深入分析菊苣葉片鎘質量比與其光譜反射率間關系，揭示指示鎘質量比時空變化的穩(wěn)定特征波段，實現(xiàn)光譜鎘脅迫監(jiān)測的便捷化和無損化。

2.4 基于FDR-PLS監(jiān)測模型的葉片鎘質量比特征波段確定

2.4.1主成分因子權重分析

在確定FDR-PLS光譜診斷模型來定量監(jiān)測菊苣葉片鎘質量比后，明晰該模型中各波段權重或載荷效應對有效明確不同自變量(X，400～2 400 nm光譜反射率)對因變量(Y，葉片鎘質量比)總體潛在影響的重要性，闡明不同X對Y總體潛在影響比重，對快速篩選出葉片鎘質量比的有效波段具有重要意義。本實驗中，基于FDR-PLS的光譜監(jiān)測模型中主成分1和主成分2(PC1和PC2)可有效解釋光譜自變量和葉片鎘質量比因變量的信息61.3%與61.5%，其不同鎘脅迫對菊苣葉片鎘質量比影響的效應載荷和權重如圖4所示。對于PC1，各波段權重絕對值較高的波長分別位于659、717、954、1 026、1 093、1 234、1 295、1 630、1 745、1 845 nm，PC2則分別為503、604、659、979、1 026、1 075、1 255、1 405、1 943 nm，兩者出現(xiàn)較多的波段重合或鄰近。

表1 基于原初和一階微分光譜的菊苣葉片鎘質量比高光譜不同監(jiān)測模型對比分析

圖4 基于FDR-PLS的菊苣葉片鎘質量比監(jiān)測模型主成分1與主成分2各波長權重

2.4.2基于FDR-PLS分析的葉片鎘質量比有效波段確定

明確了菊苣葉片鎘質量比最優(yōu)光譜監(jiān)測模型(FDR-PLS)和各波段權重之后，為進一步篩選菊苣葉片鎘質量比快速反演的有效波段，降低光譜診斷復雜度，提高光譜分析便捷性和時效性，采用PLS模型中的定量評價指標：變量重要性投影值(VIP)的研究方法，分別計算全光譜中(400～2 400 nm)各波段對菊苣葉片鎘質量比影響大小的VIP值(圖5)。VIP臨界值通常為1.0，本研究中由于高于1.0的特征波段較多且十分集中，難以有效區(qū)分和篩選，因此以VIP取2.5為菊苣葉片鎘質量比有效波段選取的臨界值。基于此，確定菊苣葉片鎘質量比有效波長分別為659(紅光)、725(紅邊)、907、1 026、1 112、1 255(近紅外)、1 630 nm(中紅外)，該結果與上述主成分因子效應載荷分析PC1和PC2中各波段權重絕對值較大的特征波段相吻合，進一步說明本有效波段選擇的可靠性與穩(wěn)定性，同時也為作物鎘脅迫的快速和精準監(jiān)測提供了實驗參考和理論依據(jù)。

圖5 基于FDR-PLS監(jiān)測模型的菊苣葉片鎘質量比有效波段確定

2.5 基于有效波段的模型驗證

2.5.1獨立驗證集驗證

基于VIP分析方法確定菊苣葉片鎘質量比有效波段，使光譜監(jiān)測波段維數(shù)由2 401個減為7個，極大降低了光譜分析的復雜性。為進一步檢驗基于上述有效波段所構建FDR-PLS模型在預測鎘質量比時的準確度，利用“美洲菊苣”獨立實驗數(shù)據(jù)對上述模型進行再次驗證，以R2、RMSE和RPD來綜合評價模型的魯棒性，并繪制1∶1比例圖來直觀展示新FDR-PLS模型的精準性(圖6)。與全波段FDR-PLS光譜監(jiān)測模型相比，采用降維后基于有效波段新構建FDR-PLS模型預測性能雖有所降低，但仍具有較強的精準度，建模集和驗證集決定系數(shù)分別為0.868與0.834，相對分析誤差(RPD)則分別為2.74和2.41，符合模型穩(wěn)定監(jiān)測的標準及需求。該結果表明本實驗所采用光譜分析技術和優(yōu)選有效波段是可行和可靠的，具有很強的代表性與應用性。

圖6 基于有效波段的菊苣葉片鎘質量比獨立驗證集實驗模型精度驗證

2.5.2不同菊苣品種實驗再驗證

圖7 基于有效波段的菊苣葉片鎘質量比不同菊苣品種實驗集模型精度驗證

在上述驗證基礎上，再次采用目前市場上常見的9個菊苣品種在50 μmol/L鎘脅迫時的獨立實驗數(shù)據(jù)，進一步檢驗基于有效波段所構建FDR-PLS模型在預測鎘質量比時的穩(wěn)定性(圖7)。結果表明，獨立實驗驗證集R2、RMSE、RPD分別為0.817、13.0 mg/kg、1.77，生物學意義為基于有效波段新構建FDR-PLS模型的實測鎘質量比可以解釋81.7%的預測集，其誤差為13.0 mg/kg，效果較為理想，滿足模型預測準確度需求。但同時也應看到，驗證集RPD為1.77，位于1.40～2.0范圍，表示模型的精確性符合“可接受”范疇但仍有進一步提高空間。綜上分析，本實驗所確定菊苣葉片光譜定量監(jiān)測模型(FDR-PLS)和7個有效波段具有較強的精準度和可利用性，為開展作物外源重金屬脅迫的高光譜快速及無損監(jiān)測提供了參考與借鑒。

3 討論

3.1 鎘脅迫對菊苣葉片高光譜反射率變化特性影響的營養(yǎng)機制

研究表明，鎘脅迫對作物生長發(fā)育具有極強的危害性，較低濃度鎘即對植株幼苗光合色素(葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等)與葉片結構(生物量、葉面積、葉片解剖參數(shù)等)產(chǎn)生明顯的毒害作用，而兩者則是影響葉片光譜變化的最關鍵因素[19-21]。本實驗中，不同濃度重金屬鎘脅迫下菊苣葉片光譜反射率表現(xiàn)出較大的差異性，尤其是在可見光至近紅外區(qū)(400～1 300 nm)(圖3)。與金銘[22]研究結論相一致，隨鎘脅迫程度加劇，3個菊苣品種葉片光譜反射率均表現(xiàn)為葉綠素強吸收帶深度變淺，550 nm附近光譜反射率降低；近紅外區(qū)葉片光譜對鎘脅迫具有敏感響應，主要是由于Cd2+進入植物體后首先在細胞壁產(chǎn)生積累，而后與膜蛋白親離子基相結合，繼而引起膜結構、細胞解剖結構和葉片宏觀長勢發(fā)生改變，影響光在葉片及細胞間傳輸路徑，繼而在光譜上形成了反射率不同的波譜曲線。以“歐洲菊苣”為例，六葉期0、5、10、25、50、100、200 μmol/L鎘濃度下其葉綠素含量平均為1.64、1.51、1.47、1.28、1.11、0.83、0.54 mg/g，地上部葉片鮮質量則分別為10.84、9.68、9.18、5.15、2.14、1.31、0.87 g/株，差異顯著。1 300 nm之后中紅外區(qū)不同鎘濃度下葉片光譜反射率變化趨勢則不盡一致，主要原因是由于雖然鎘脅迫對菊苣長勢產(chǎn)生了明顯影響，但處理間葉片含水率(本實驗中，菊苣葉片含水率均在86%～91%之間)相比于葉片色素和生物量差異則不明顯，而該區(qū)域又是水的強吸收帶[23]。

3.2 菊苣鎘脅迫高光譜監(jiān)測的穩(wěn)定模型構建

相比于逐步回歸(SWR)和主成分回歸(PCR)分析，基于偏最小二乘回歸(PLS)的菊苣葉片鎘質量比定量監(jiān)測模型無論是原始光譜(R)亦或FDR光譜，其準確度(R2)和精確度(RMSE和RPD)表現(xiàn)均相對最優(yōu)(表1)。研究認為，PLS是集典型相關分析、主成分分析和多元線性回歸分析為一體的新型多元統(tǒng)計分析方法，能夠有效利用所有自變量信息構建高魯棒性預測模型[24]。同時，PLS能夠有效抑制或避免多個自變量間的共線性問題，優(yōu)化變量信息，最大化自變量和因變量間的共線性，特別適合于自變量數(shù)較高且明顯多于因變量的光譜數(shù)據(jù)分析[25]。光譜變換方式間，采用FDR-PLS的菊苣葉片鎘質量比預測性能則明顯優(yōu)于R-PLS，主要原因可能是由于FDR處理有效降低了背景環(huán)境中空氣吸收和散射對目標光譜的影響，且FDR還可部分去除線性或接近線性背景、噪聲光譜對實驗結果的影響[26-27]，該結果與筆者前期對其他作物研究結論均一致[28]，進一步表明采用FDR-PLS模型在預測菊苣鎘質量比時的可行性與可靠性。

3.3 菊苣鎘脅迫高光譜監(jiān)測的有效波段確定

在明確重金屬鎘脅迫光譜響應特征及構建穩(wěn)定監(jiān)測模型基礎上，尋求能穩(wěn)定預測鎘脅迫程度及鎘濃度時空變化的特征波段或有效波段，對提高光譜診斷時效性和分析效率，降低開發(fā)便攜式光譜監(jiān)測儀器成本等均具有重要意義。本研究中，基于FDR-PLS中各波段VIP值，確定菊苣葉片鎘質量比有效波長為659、725、907、1 026、1 112、1 255、1 630 nm(圖5)。其中，659、725 nm波長位于可見光區(qū)的“紅邊”范圍，該區(qū)域是由于作物葉綠素強吸收和葉片結構的高反射所致，是指示作物鎘脅迫程度、營養(yǎng)狀況及群體結構的重要波段[29-30]；907、1 026、1 112、1 255 nm波長則位于近紅外區(qū)，是反映作物結構特性的關鍵波段。本實驗中，隨鎘脅迫程度增加，菊苣植株變小，莖稈纖細，葉面積和葉片厚度均明顯降低，顯著影響葉片對光的吸收與利用性能，而上述特征變化在光譜曲線上的響應則主要集中在近紅外區(qū)(圖3)。1 630 nm波長則位于中紅外區(qū)，是指示葉片水分狀況的特征波段，雖然不同鎘濃度脅迫間菊苣葉片含水率差異不大，但整體而言，隨鎘脅迫程度加劇其葉片呈發(fā)黃枯萎狀，葉片含水率則相對較低，進一步說明基于葉片原位高光譜對反演作物鎘脅迫狀況的準確性與靈敏度。此外，基于上述有效波段所構建FDR-PLS模型仍然獲得了相對較好的預測性能，獨立驗證集和品種驗證相對分析誤差(RPD)分別為2.41與1.77，表明前述所確定菊苣葉片鎘質量比有效波段是合理與適宜的，可以用于鎘質量比的快速和準確監(jiān)測(圖6、7)。雖然本研究數(shù)據(jù)融合了多個品種與鎘濃度脅迫效應，但實驗的開展是在特定的室內水培條件下獲得的，因此，在后續(xù)研究中可將本實驗結果與土培甚至田間試驗相融合，以進一步擴大本研究結果的推廣應用性。

4 結論

(1)鎘脅迫顯著影響菊苣葉片鎘質量比及原位高光譜反射特性。隨鎘脅迫程度的增加，其葉片鎘質量比在3個供試品種間均明顯提升；葉片原位高光譜反射率在可見光-近紅外區(qū)(400～1 300 nm)則逐步降低，且近紅外區(qū)處理間差異程度弱于可見光區(qū)，中紅外區(qū)(1 300～2 400 nm)光譜反射率未表現(xiàn)出明顯或一致性變化規(guī)律。

(2)全波段光譜分析模型間，以基于一階微分光譜(FDR)的偏最小二乘回歸(PLS)模型預測性能表現(xiàn)最優(yōu)，即FDR-PLS，其獨立驗證集決定系數(shù)(R2)、均方根誤差(RMSE)和相對分析誤差(RPD)分別為0.92、181.3 mg/kg和2.96，滿足模型精準預測需求。

(3)在明確菊苣葉片鎘質量比最佳預測模型FDR-PLS后，根據(jù)各波段無量綱評價指標VIP值，確定其特征波長分別為659、725、907、1 026、1 112、1 255、1 630 nm，實現(xiàn)了光譜便捷和高效分析的目的。此后，基于上述有效波長構建FDR-PLS監(jiān)測模型，其獨立驗證集R2、RMSE、RPD分別為0.834、222.4 mg/kg和2.41，9個供試品種驗證集R2、RMSE、RPD則分別為0.817、13.0 mg/kg和1.77，預測效果較為理想。