納米ZnO-Ag復合材料對小麥根腐病菌侵染下小麥幼苗生長的影響

郭艾英，許曉越，楊曉妮，齊艷玲，蔡愛軍

(河北科技師范學院農學與生物科技學院，河北秦皇島 066004)

小麥是全球分布范圍最廣的糧食作物，其產量和種植面積均居世界谷物的首位[1]。小麥產量與其生長狀況有關，其生長過程中易受到多種病害的危害，導致產量降低或品質變差，其中土傳病害尤為嚴重[2]。麥根腐平臍孺孢(Bipolarissorokiniana)是一種能夠侵染小麥的重要土傳病原菌，該病菌引發的病害在小麥整個生育期均可發生，通常表現為種子發芽率低、根腐病、莖基腐病、葉斑病和穗腐病等癥狀，導致小麥大幅減產，嚴重時減產超過50%[3-6]。小麥根腐病在中國北部地區比較普遍，近年來在廣東、福建等小麥種植區也有發現，對小麥安全生產造成嚴重威脅[7]。

目前，小麥根腐病的防治主要以化學藥劑處理種子為主，以農田作物輪作、篩選抗病品種、生物防治等為輔[8]。化學藥劑處理種子能夠有效降低病害發生幾率，但長期不合理使用不僅導致病原菌對藥劑產生抗性，破壞土壤微生物群落平衡，也造成了環境污染[9-10]。農田作物輪作與種植區域有關，利用水旱輪作可有效降低土壤中有害病原菌的存活率[11-12]。利用抗病品種防治小麥根腐病，經濟安全，但選育工作時間不僅長，而且在種植過程中植株的抗病能力普遍較差[13-14]。生物防治對于降低病菌數量、恢復土壤健康有重要實踐意義，但土壤自然環境多變，病菌種類多樣，生防微生物定殖能力差，且生防菌具有定向性，難以大規模使用[15-16]。因而，小麥根腐病防治仍是一個亟待解決的難題。

近幾年，隨著納米技術的發展，納米抗菌材料應運而生。與傳統化學藥劑相比，納米材料具有安全、高效、廣譜、不易產生抗藥性等特點，已成為當前領域的研究熱點。已有研究表明，納米銀對多種細菌、真菌和支原體具有強烈的抑制作用，是一種良好的無機抗菌材料[17]。Mishra等[18]采用生物法合成的納米銀粒子能夠抑制小麥葉片上小麥根腐菌分生孢子的萌發，降低小麥植株感染葉斑病的幾率。Mishra和Singh[19]研究發現，納米銀在低濃度時顯著抑制小麥根腐菌菌絲的生長。李琴琴等[20]采用化學還原法制備的納米銀能夠破壞小麥赤霉病菌完整性，抑制病菌生長。Ali等[21]采用苦艾水提取物合成納米銀材料對引發植物病害的六種寄生疫霉菌具有抗疫能力，能夠提高植物存活率。2016年陳娟妮等[22]采用靜電自組裝法合成石墨烯-納米銀材料，4.68 μg·mL-1的濃度就能夠抑制禾谷鐮刀菌分生孢子萌發，抑制離體葉片上病斑的發展。這些研究結果表明，納米銀對植物病原菌分生孢子萌發和菌絲生長具有顯著抑制作用，但是關于納米銀對病菌侵染下植物生長影響的研究尚不多見。

本研究以楊樹葉為生物模板制備納米ZnO-Ag復合材料，探究ZnO-Ag對根腐病菌菌殺菌活性，通過盆栽試驗，在土壤接種小麥根腐菌情況下，測定納米ZnO-Ag復合材料對小麥種子萌發和幼苗生長的影響，旨在為小麥根腐病的田間防治提供參考，為ZnO-Ag的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株和培養基

本研究所用麥根腐離孺孢菌(B.sorokiniana)，由中國農業科學院作物科學研究所作物遺傳育種中心提供。PDA固體培養基：稱取馬鈴薯200 g，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，趁熱過濾后加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌30 min，備用。

1.1.2 供試小麥和土壤

供試的京東8號小麥由河北科技師范學院植物生理與生物技術實驗室提供。播種前種子用3% H2O2浸泡10 min，無菌水清洗3次。將種子浸泡于無菌水中，12 h后選取顆粒飽滿種子，備用。供試土壤取自河北科技師范學院試驗田，土壤置于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃，滅菌1 h，殺滅可能存在的微生物和孢子，晾干備用。重復3次，盆缽為塑料盆，上口內徑9 cm，盆底內徑 7 cm，高7.5 cm，于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃，滅菌15 min，備用。

1.2 方 法

1.2.1 納米ZnO-Ag復合材料的制備

采用生物模板法合成納米材料。以楊樹葉片為模板，將新鮮的楊樹葉片用去離子水清洗干凈，置于2%(v/v)戊二醛溶液中固定6 h。用去離子水清洗后，將葉片浸泡于2%( v/v)的鹽酸溶液中，12 h后去離子水清洗。將葉片置于100 mL溶有Zn(NO3)2(0.08 M)和AgNO3(0.06 M)的溶液中，60 ℃保溫72 h。將葉片水洗風干，置于馬弗爐中500 ℃煅燒2 h，研碎即得。利用X-射線衍射(X-ray diffraction，XRD)和透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)對材料成分和形貌進行分析。

1.2.2 小麥根腐菌的活化與培養

將保藏的小麥根腐菌菌液涂布于PDA固體培養基上，28 ℃培養4～5 d，用打孔器取直徑為 6 mm的菌餅轉接于新的PDA固體培養基中， 28 ℃培養，待菌絲鋪滿平板后置于4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.3 納米ZnO-Ag復合材料對小麥根腐菌菌絲抑制效果的測定

采用菌絲生長速率法測定。具體步驟：無菌條件下，用滅菌的PAD培養基稀釋納米ZnO-Ag復合材料，終濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg·mL-1，以不加ZnO-Ag材料的培養基為對照。取生長一致直徑為6 mm的小麥根腐菌菌餅接種至上述平板中心，28 ℃靜置培養，每個處理重復3次。待對照菌落鋪滿平板時停止培養，沿平板直徑十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-0.6 cm)

1.2.4 納米ZnO-Ag復合材料對小麥根腐病菌侵染下小麥幼苗生長效應的測定

盆栽試驗參考張姍姍等[23]研究方法，于2019年3月中旬在河北科技師范學院植物生理與生物技術實驗室實施。滅菌后盆缽中裝入供試土壤，每盆500 g。納米ZnO-Ag復合材料用無菌水稀釋，超聲處理30 min。每盆分次加入50 mL不同濃度的ZnO-Ag復合材料溶液，使土壤中材料終濃度分別為12.5、25、50、100、200 μg·g-1，每個濃度5次重復，對照加入50 mL無菌水。將直徑為6 mm的小麥根腐菌餅分成4份均勻埋入土中，約5 cm深，28 ℃培養1周使病菌充分生長。之后每盆均勻播種小麥12粒，約3 cm深，于培養箱中培養。光周期設置為白天14 h、22 ℃，夜晚10 h、18 ℃，相對濕度80%。每天使用無菌水灌溉，維持小麥正常生長。

1.2.5 測定項目

小麥播種后第3天測定發芽勢，7 d測定發芽率。播種21 d后，將盆中所有幼苗連根拔出，洗凈，測定幼苗發病率，幼苗發病數是幼苗根部變褐、腐爛死亡的幼苗數和未萌發種子數之和。將幼苗以子葉著生部位為準分開地上、地下部分，分別測量根長和株高，稱量鮮重后置于烘箱中85 ℃烘干至恒重，并計算根冠比。

發芽勢=前3 d發芽種子總數/供試種子粒數×100%

發芽率=7 d發芽種子粒數/供試種子粒 數×100%

幼苗發病率=(未萌發種子數+發病幼苗數)/供試種子數×100%

根冠比=地下部分干重/地上部分干重

1.3 數據處理

采用Excel 2017進行數據整理和繪圖，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析和LSD顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 納米ZnO-Ag復合材料的表征

利用生物模板法制得的納米ZnO-Ag復合材料呈黑色細粉狀。XRD分析圖譜(圖1A)顯示為尖銳峰，表示材料的結晶度較好。圖1A標注*的為ZnO衍射峰，2θ值在31.68°、34.32°、 36.16°、47.44°、56.50°、62.76°和67.86°處，與標準卡(JCPDS No.36-1451)[24]上(100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103)和(112)晶面所對應的2θ值基本一致。圖1A標注#的光譜2θ值，從小到大依次對應Ag的四個晶面(111)、(200)、(220)和(311)，這與Ag的標準圖譜卡片(JCPDS No.04-0783)相吻合[25]。TEM結果(圖1B)表明，該材料為近圓形的納米層狀結構，平均顆粒直徑為30～50 nm。高分辨透射電子顯微成像(high-resolution transmission electron microscopy，HRTEM)結果表明，晶格間距為0.26 nm對應ZnO的(002)晶面[26]，晶格間距為0.23 nm對應Ag的(111)晶面[27]，由此可進一步確定，本材料為ZnO與Ag的復合體。

圖1 納米ZnO-Ag復合材料的XRD衍射花樣(A)、TEM圖(B)和HRTEM圖(C)Fig.1 XRD patterns(A), TEM image(B) and HRTEM image(C) of ZnO-Ag nanocomposites

2.2 納米ZnO-Ag復合材料的抑菌效果

由表1可知，納米ZnO-Ag復合材料能夠抑制小麥根腐菌菌絲的生長，菌絲生長抑制率隨材料濃度的升高而增大，200 μg·mL-1ZnO-Ag對病菌菌絲生長抑制率高達91.17%；不同濃度復合材料處理的病菌菌絲生長抑制率間差異均顯著(P<0.05)。納米ZnO-Ag對病菌的毒力回歸方程為y=2.581 8+1.577 1x，EC50=34.15 μg·mL-1，說明ZnO-Ag復合材料對小麥根腐病菌的抑制作用較強。

表1 納米ZnO-Ag復合材料對小麥根腐菌菌絲生長影響Table 1 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on growth of Biploaris sorokiniana

2.3 納米ZnO-Ag復合材料對根腐病菌侵染下小麥種子萌發的影響

由表2可知，隨著土壤中納米ZnO-Ag復合材料濃度增加，小麥種子的發芽勢和發芽率均逐漸升高。 12.5 μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥種子發芽勢與對照無顯著差異，其他濃度處理組發芽勢顯著升高(P<0.05)。200 μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥種子發芽勢顯著高于12.5、25、 50 μg·g-1處理組，與100 μg·g-1處理組無顯著差異，而ZnO-Ag濃度為25、50、100 μg·g-1處理間小麥種子發芽勢無顯著差異。不同濃度ZnO-Ag處理的小麥種子發芽率均顯著高于對照。12.5 μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥發芽率顯著低于其他濃度處理，濃度為25、50、100、200 μg·g-1處理間發芽率無顯著差異。

表2 納米ZnO-Ag復合材料處理對小麥種子萌發的影響Table 2 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on germination of wheat seeds %

2.4 納米ZnO-Ag復合材料對根腐病菌侵染下小麥幼苗生長的影響

2.4.1 對小麥幼苗根長和株高的影響

由圖2A、圖2B可知，ZnO-Ag復合材料處理的小麥幼苗根長和株高均顯著高于對照(P< 0.05)。由圖2A可知，經50 μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥幼苗根長最長，平均為9.88 cm，顯著高于其他處理；ZnO-Ag濃度為25、100 、200 μg·g-1處理的小麥幼苗根長顯著高于12.5 μg·g-1處理，前三個濃度處理間無顯著差異(P<0.05)。由圖2B可知，50μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥幼苗株高最高，平均為20.13 cm，顯著高于12.5、25 μg·g-1處理組，與100、200 μg·g-1濃度處理組無顯著差異(P<0.05)。

圖柱上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters above columns mean significant difference among treatment at 0.05 level. The same in figures 3-6.圖2 納米ZnO-Ag復合材料對小麥根長和株高的影響Fig.2 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on the length of wheat root and the height of wheat seedlings

由圖3可知，隨著土壤中納米ZnO-Ag復合材料濃度的升高，小麥根長/株高逐漸降低。12.5 μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥幼苗根長/株高與對照間無顯著差異，其他濃度處理顯著低于對照組(P<0.05)。濃度為25、50、100、200 μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥幼苗的根長/株高較對照組分別降低了18.9%、18.3%、21.6%和24.8%，各濃度處理間無顯著差異(P<0.05)。

圖3 納米ZnO-Ag復合材料對小麥根長/株高的影響Fig.3 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on the ratio of wheat root length and seedling height

2.4.2 對小麥幼苗鮮重和干重的影響

由圖4A、4C可知，隨著土壤中納米ZnO-Ag復合材料濃度的升高，小麥幼苗地下部鮮重、干重呈上升趨勢，且均顯著高于對照處理(P<0.05)。200 μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥幼苗地下部鮮重、干重均顯著高于其他濃度處理組，較對照組分別升高8.93和8.37倍；ZnO-Ag濃度為50和100 μg·g-1處理間小麥幼苗地下部鮮重、干重均無顯著差異(P<0.05)。由圖4B、4D可知，不同濃度納米ZnO-Ag復合材料處理的小麥幼苗地上部鮮重、干重均顯著高于對照組，12.5、25、50、100、200 μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥幼苗地上部鮮重較對照組分別升高2.47、8.39、24.90、23.15和29.62倍，干重較對照組分別升高2.16、4.14、7.22、 7.36和9.05倍。ZnO-Ag濃度為50和100 μg·g-1處理間小麥幼苗地上部鮮重、干重均無顯著差異，其他濃度處理間差異顯著 (P<0.05，圖4B、4D)。

圖4 納米納米ZnO-Ag復合材料對小麥幼苗地下部和地上部鮮重、干重的影響Fig.4 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on the weight of wheat root and shoot

2.4.3 對小麥幼苗根冠比的影響

由圖5可知，與對照相比，土壤中添加濃度為12.5 μg·g-1ZnO-Ag復合材料處理的小麥幼苗根冠比顯著升高，而25、50、100、200 μg·g-1ZnO-Ag處理組顯著降低(P<0.05)。12.5 μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥幼苗根冠比為 1.35，較對照組升高28.6%，其他濃度為ZnO-Ag處理的小麥幼苗根冠比都低于1.0，且各濃度處理間無顯著差異(P<0.05)。

圖5 納米ZnO-Ag復合材料對小麥根冠比的影響Fig.5 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on the root-shoot ratio of wheat

2.5 納米ZnO-Ag復合材料對根腐病菌侵染下小麥幼苗發病率的影響

由圖6可知，隨ZnO-Ag復合材料濃度的增加小麥幼苗發病率逐漸下降。12.5μg·g-1材料處理的小麥幼苗發病率與對照組相比無顯著差異(P<0.05)，而25、50、100、200 μg·g-1ZnO-Ag處理組均顯著降低，較對照組分別降低了 16.67%、40.00%、46.67%和48.33%。25 μg·g-1ZnO-Ag處理的小麥幼苗發病率顯著高于50、100、200 μg·g-1材料處理組，ZnO-Ag濃度為50、100、200 μg·mL-1處理間無顯著差異(P<0.05)。

圖6 納米ZnO-Ag復合材料對小麥幼苗發病率的影響Fig.6 Effect of ZnO-Ag nanocomposites on the incidence of wheat seedling

3 討 論

由于病原菌的變異和對化學藥劑的抗性，使得農業生產上化學藥劑的施用濃度越來越高，導致植物病原菌對殺菌劑的抗性越來越強[28]。長期下去，這種連鎖效應會越來越厲害，嚴重威脅農作物的生產。近幾年國內外研究者將納米技術應用在植物病害防控上，為有效解決農作物病害開辟了新途徑[29]。

本研究發現，納米ZnO-Ag復合材料能顯著抑制小麥根腐菌菌絲的生長，抑制作用呈現劑量效應。200 μg·mL-1ZnO-Ag復合材料對根腐病菌菌絲生長抑制率達91.17%，EC50為34.15 μg·mL-1。Mishra等[18]采用生物法合成的納米銀濃度為10 μg·mL-1時，可抑制小麥根腐菌分生孢子的萌發；0.05 mg·mL-1的納米銀顯著抑制病菌菌絲生長，濃度為0.1 mg·mL-1時完全抑制病菌菌絲生長[19]。李琴琴等[20]制備的納米銀濃度為10 μg·mL-1時，對小麥赤霉病菌菌絲生長抑制率達90%。王虎軍等[30]發現，0.8 mg·mL-1納米ZnO對甜瓜致病菌粉紅單端孢、鐮刀菌菌絲生長抑制率分別為77.8%和74.3%，當ZnO濃度為2.4 mg·mL-1時，對交鏈孢菌絲生長抑制率為76.7%。Yehia和Ahmed[31]研究發現，粒徑為70±15 nm的ZnO納米粒子濃度12 mg·L-1時，對尖孢鐮刀菌和擴展青霉菌的菌絲生長抑制率分別達到77%和100%。因此，在植物病害防治方面，ZnO納米粒子和銀納米粒子顯示出良好的抗菌性能，可為植物病害防控提供新方法。

種子萌發和幼苗生長階段是植物感知外界環境變化的敏感階段，其生長狀態直接影響植物后續的生長和發育。根腐病的發生不僅能夠降低小麥種子發芽率、影響小麥幼苗生長，而且嚴重影響小麥的產量和品質[32]。本研究結果表明，在土壤接種小麥根腐病菌情況下，向土壤中加入ZnO-Ag復合材料，小麥種子的發芽勢和發芽率、小麥幼苗的根長、株高、地上部鮮重和干重、地下部鮮重和干重與對照組相比均有不同程度升高，小麥幼苗發病率降低，這與小麥受土傳病害侵染時采用生防菌處理對小麥幼苗影響一致[33-34]。本研究結果說明，納米ZnO-Ag復合材料能夠抑制土壤中小麥根腐病菌生長，促進小麥種子萌發和幼苗生長，降低小麥幼苗發病率。

根系是植物吸收營養物質的主要組織，土壤中營養物質的可利用度取決于植物所處的環境。植物的根長和株高可以反應植物生長情況及適應外界環境能力，其比值是植物同化資源分配的一種表現[35]。在逆境環境下(如干旱脅迫)，植物為維持生存根系生長加快，根生物量和長度大，根冠比高[36]。本研究結果表明，土壤接種根腐病菌情況下，隨著納米ZnO-Ag復合材料濃度的增加，小麥幼苗根長/株高逐漸降低。這可能是在根腐病菌侵染下，對照組小麥通過增加根的生長量抵御病菌傷害，而處理組中ZnO-Ag抑制了病菌生長，病菌對根生長抑制作用減弱，因而根長/株高降低。小麥幼苗根冠比隨著土壤中ZnO-Ag處理濃度的升高呈先升高后降低趨勢，這可能是病菌侵染下，小麥幼苗地上部和地下部生長都受到抑制；12.5 μg·g-1ZnO-Ag處理根冠比最高，說明此環境嚴重抑制小麥地上部分的生長，這可能是低濃度ZnO-Ag對病菌抑制作用較差，植物通過增加根的干生物量來抵御病害，高于此濃度，ZnO-Ag對病菌抑制作用增強，病菌對植物根生長影響減小，由此生物量傾向于向地上分配，以利于植株獲取地上資源，保證植物適應逆境環境。這與他人研究植物在逆境中生長，外源調節對植物生長的影響結果一致[36-37]。

近年來，由于小麥栽培模式單一化、田間管理不善、缺乏抗病品種和播種者防病意識差等原因導致小麥根腐病害越來越嚴重，傳統的方法已遠遠不能有效防治植物病害[8]，納米抗菌技術的發展為植物病害防控注入了新活力，在植物病害防控方面發揮了積極作用[29]。本研究中制備的納米ZnO-Ag復合材料能有效抑制小麥根腐病菌生長，在小麥受到病菌侵染時，能夠通過抑制病菌菌絲生長，促進小麥種子萌發和幼苗生長，降低小麥幼苗發病率，由此證明該復合材料可用于小麥根腐病害防治。納米銀粒子一般通過釋放銀離子破壞細菌的細胞壁和細胞膜，或者直接接觸菌體使菌體內產生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)等機制殺菌或抑制菌體生長[38]，但是該復合材料如何抑制小麥根腐病菌菌絲的生長尚不清楚。另外納米銀粒子在自然界中釋放對植物生長的影響，以及是否會造成生態環境污染還需進一步研究。