小麥莖基腐病和赤霉病抗源篩選及關聯(lián)SNP位點分析

蒲樂凡，任 慧，歐楊晨，任慧莉，曾慶東，胡小平，李春蓮，韓德俊

(1.西北農林科技大學農學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.西北農林科技大學植物保護學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

小麥莖基腐病(crown rot，CR)和赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是由鐮孢菌引起的兩種主要的小麥病害。這兩種病害會造成小麥嚴重的產量損失和品質下降，而且病粒中會產生和積累以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)為主的真菌毒素，食用后可引起人畜中毒[1-2]。CR最早被發(fā)現(xiàn)于澳大利亞[3]，目前在澳大利亞、歐洲、南美、北美、西亞、北非和南非等地小麥種植區(qū)危害尤為嚴重[4-5]。FHB在世界范圍內的小麥種植區(qū)廣泛發(fā)生。我國是全球小麥赤霉病受害面積最大的國家之一，發(fā)病區(qū)域主要集中在長江中下游冬麥區(qū)和東北東部春麥區(qū)，近年來已經(jīng)蔓延至黃淮麥區(qū)。由于引起CR和FHB的病原菌均為鐮孢菌，而且該致病菌能引起多種禾谷類作物相似的病害，因而造成一些稻—麥輪作區(qū)和小麥—玉米輪作區(qū)病原菌生活的周年循環(huán)，加之秸稈還田和免耕等耕作措施的推廣應用，使得菌源量逐年增加，從而加重了這些地區(qū)的病害流行。近年來，黃淮麥區(qū)包括河北、河南、安徽、山東、江蘇及陜西，CR和FHB已成為小麥生產上的重大病害，嚴重威脅著小麥的安全生產[6-8]。

種植抗病品種是控制小麥病害流行最經(jīng)濟有效的途徑，鑒定和篩選優(yōu)異抗源是進行小麥抗病育種的基礎。由于小麥對CR和FHB的抗性屬于數(shù)量性狀，遺傳基礎復雜，易受環(huán)境影響，因而在抗源的鑒定、篩選和利用上存在一定的困難。國內外的科學家很早就開展了小麥赤霉病抗源鑒定和篩選工作，篩選出了一批抗性穩(wěn)定的抗源，如來自日本的Shinchunaga和Nobeokabouzu，巴西的Frontana和Encruzilhada，美國的Ernie和Freedom，歐洲的Praa 8和Novkrumka，以及中國的望水白、蘇麥3號和寧7840[9-13]。其中，蘇麥3號目前仍然是世界公認抗性最好的抗源，而且已被廣泛運用于育種實踐。然而，蘇麥3號廣泛使用所帶來的抗源單一問題及其在育種中存在的很多負效應，促使育種家去尋找新的抗源[14]。截止目前還沒有發(fā)現(xiàn)對CR免疫的材料，高抗的種質資源也極為稀少[15]。國內外有關不同小麥品種(系)對莖基腐病抗性研究已有一些報道，但發(fā)現(xiàn)的抗性品種(系)數(shù)量較少，而且多表現(xiàn)中抗，缺乏高抗品種[16-18]。生產上急需篩選并創(chuàng)制新的抗病材料，以提高小麥抗CR和FHB水平。

目前，已在不同小麥抗源材料中定位了數(shù)百個與FHB相關的QTL，分布在除1D、3D、5B和5D外的染色體上。明確的抗病基因有7個(Fhb1～Fhb7)，其中Fhb1位于3BS染色體上，是國內外公認的抗性穩(wěn)定且效應最大的位點，已在育種中得到廣泛的應用，目前育成抗赤霉病品種大多攜帶Fhb1基因[20]。已定位與CR相關的QTL涉及小麥的13條染色體[15]。Wallwork等[21]在4B染色體上矮稈基因Rht1附近定位了一個CR成株抗性QTL，來源于抗性品種Kukri；Ma等[26]在3B和4B染色體上各定位了一個QTL(Qcrs.cpi-3B和Qcrs.cpi-4B)，分別來源于兩個親本，且具有較強的互作效應。Bovill等[27]利用抗源Sunco的兩個雙單倍體(DH)群體在染色體1B、1D、2B、3B、4B、5B、5D、6B和7A上均定位到了CR苗期抗性QTL；Poole等[28]利用Sunco/Macon和Sunco/Otis重組自交系(RIL)群體在染色體1A、1D、2B、3B、4B、4D和7A上定位到了與CR相關的QTL，其中位于3BL染色體上的QTL(Qcrs.wsu-3BL)效應最顯著且在兩個群體和多個環(huán)境中均能檢測到，該QTL位于SSR標記Xgwm247和Xgwm299區(qū)間，遺傳距離為1.8 cM，且Qcrs.wsu-3BL與Qcrs.cpi-3B[26]和Qcr.usq-3B.1[27]可能為同一位點。Zheng等[29]分別在2D、4B和5D染色體上定位了4個與CR抗性相關的QTL，其中兩個主效QTL分別位于5DS (Qcrs.cpi-5D)和2DL(Qcrs.cpi-2D)上。Zheng等[30]對Qcrs.cpi-3B進行了精細定位，將其定位在遺傳距離為0.7 cM、物理距離為1.5 Mb區(qū)間內，并開發(fā)了7個共分離標記，篩選了63個編碼序列，其中6個編碼抗病蛋白。Yang等[25]利用GWAS技術鑒定出與CR抗性相關的286個SNP位于小麥第6同源群，其中6A上有266個SNP位于7.0 Mb區(qū)間，包含51個注釋基因，并將抗性QTL定位在小麥6A、2D、2A染色體上，其中位于6A染色體上的QTL為主效位點，與標記AX-111106634緊密連鎖，與GWAS結果相互印證。本研究1 000多個來自世界各地的小麥種質中篩選311個核心種質為供試材料，對其同時進行CR苗期和成株期抗性及FHB抗性鑒定，并利用全基因組關聯(lián)分析(GWAS)鑒定與CR和FHB抗性相關的SNP位點，以期篩選出對CR和FHB具有抗性或兼抗兩種病害的小麥種質，為小麥兼抗CR和FHB基因的定位和育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

禾谷鐮孢菌FHB001菌株，由西北農林科技大學植物保護學院土傳病害課題組提供。

假禾谷鐮孢菌CX-46菌株，由西北農林科技大學植物保護學院土傳病害課題組從陜西富平縣小麥莖基腐病株上分離得到，是具有強致病性的菌株。

1.1.2 供試小麥種質

已完成660K芯片基因分型的311份小麥核心種質，由西北農林科技大學旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室提供。抗赤霉病對照品種蘇麥3號，由南京農業(yè)大學賈海燕教授提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種病麥粒制備

純化的莖基腐病菌株CX-46接種到PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃下活化培養(yǎng)3～4 d，則PDA培養(yǎng)基上長滿菌絲。小麥籽粒在清水中浸泡過夜，在開水鍋中煮30 min，晾干表面水分后分裝至500 mL組培瓶中，121 ℃下滅菌30 min后，于烘箱中烘干3～5 h，即為麥粒培養(yǎng)基。將活化培養(yǎng)的菌餅混入麥粒培養(yǎng)基中，置于22 ± 1 ℃培養(yǎng)14～21 d，每天搖動培養(yǎng)瓶，使菌絲充分生長，菌絲量一致。

1.2.2 病原菌孢子懸浮液的制備

綠豆液體培養(yǎng)基制備：稱取綠豆60 g，洗凈后加入1 000 mL蒸餾水，加熱煮沸10 min，濾液分裝至100 mL三角瓶中，121 ℃滅菌30 min，冷卻后即為綠豆液體培養(yǎng)基。

挑取活化的禾谷鐮孢菌FHB001菌絲接種到綠豆液體培養(yǎng)基中，于25 ℃下振蕩培養(yǎng)，轉速為150 r·min-1。4～5 d后取少量培養(yǎng)液用血球計數(shù)板計數(shù)孢子懸浮液濃度，當濃度大于1×106個·mL-1時，用無菌細紗布過濾，濾液即為病原菌孢子懸浮液，將其于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 莖基腐病苗期抗性鑒定

試驗在西北農林科技大學溫室內進行。將無菌基質土裝入7 cm×7 cm×8 cm的方形小花盆中，表面經(jīng)過消毒的小麥種子播種于花盆中，播種深度2～3 cm，每盆10粒。待小麥出苗長至二葉期，在每株小麥基部放置2粒經(jīng)CX-46菌株擴繁的病麥粒，然后覆蓋一層基質。接種后澆水保濕3 d，其后減少澆水量，以小麥不因缺水致死為宜。溫室溫度白天為22 ± 2 ℃，夜間溫度為15 ± 2 ℃，自然光照。3個重復，隨機排列。接種后 35 d左右調查發(fā)病情況。采用0～6級分級標準[19]進行病害嚴重度劃分。

1.2.4 莖基腐病成株期抗性鑒定

CR成株期抗性鑒定在西北農林科技大學北校區(qū)試驗地進行。于當年10月初播種，行長 1.0 m，行寬0.25 m，每行播種30粒，每材料播種2行。3個重復，隨機區(qū)組排列。翌年小麥拔節(jié)期，地面澆水以保證接種時土壤有一定的濕度。將吸有1 mL濃度為1×106個·mL-1的CX-46孢子懸浮液無菌脫脂棉纏繞在離地面1.0 cm高的莖基部，每材料每重復選擇1行接種10株。后期同正常小麥生長田間管理，乳熟期調查發(fā)病情況。采用0～4級反應分級標準[19]進行病情嚴重度劃分。

1.2.5 赤霉病抗性鑒定

試驗地點和栽培方式同1.2.4。于小麥揚花初期采用單花滴注法接種：選取麥穗中部小穗的第一朵小花，輕剝開穎殼，用1 mL醫(yī)用注射器，將20 μL濃度為1×106個·mL-1的FHB001孢子懸浮液注射至小花雌蕊上，然后將噴淋蒸餾水的黑色塑料袋套住麥穗保濕48 h左右，并掛牌標記。每材料重復接種10穗。接種后21 d左右進行病情調查。蘇麥3號為抗病對照，病害分級標準采用國家標準(GB/T15976-2011)： 0級：未發(fā)病；1級：發(fā)病小穗數(shù)占全部小穗數(shù)的<25%以下；2級：25%<發(fā)病小穗數(shù)≦50%；3級：50%<發(fā)病小穗數(shù)≦75%；4級：發(fā)病小穗數(shù)>75%。

1.2.6 小麥莖基腐病和赤霉病抗性全基因組關聯(lián)分析

采用TASSEL 5.0軟件中的混合線性模型(mixed linear model，MLM)，以Structure運算后的Q值和親緣關系K值作為協(xié)變量，結合SNP芯片基因型數(shù)據(jù)，進行性狀與標記的關聯(lián)分析，確定關聯(lián)位點。與性狀顯著關聯(lián)的SNP位點閾值設為P<0.000 01。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

根據(jù)以下公式計算病情指數(shù)(diseases index，DI)：

病情指數(shù)=[∑(各級病株數(shù)×病級代表數(shù)值)]/(調查總株數(shù)×發(fā)病最重級的代表數(shù)值)×100

依據(jù)DI范圍將參試種質的抗性水平分為4級：抗病(R，DI<25)、中抗(MR， 25≤DI<40)、感病(S，40≤DI<55)和高感(HS，DI>55)。

采用QTL IciMapping 4.2軟件中的AOV對不同小麥種質的病情指數(shù)進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 311份小麥種質對莖基腐病和赤霉病抗性的方差分析

由表1可知，基因型對小麥莖基腐病和赤霉病DI指數(shù)的影響達到顯著水平(P<0.000 1)，而重復間差異不顯著，說明小麥種質間對CR和FHB的抗性具有顯著或不顯著差異，對種質進行抗性篩選是可行的。由圖1可以看出，311份小麥種質對CR和FHB的抗性呈連續(xù)分布，表明小麥對CR和FHB抗性是受多基因控制的。苗期和成株期CR的DI多集中在0～50之間，F(xiàn)HB的DI分布在20～100之間。

圖1 病情指數(shù)在311個種質中的分布Fig.1 Distribution of DI in 311 germplasms

表1 311個小麥種質對莖基腐病和赤霉病抗性指數(shù)的方差分析Table 1 Analysis of DI of variety to CR and FHB resistance in 311 wheat germplasms

2.2 311份小麥種質對莖基腐病和赤霉病的抗性分析

由表2可知，CR苗期(CR-SR)、成株期(CR-APR)和FHB的DI范圍分別為4.3～74.3、0～60.0和25.0～100.0。 CR苗期抗性表現(xiàn)為抗病(R)、中抗(MR)、感病(S)和高感(HS)的種質分別占8.4%、27.6%、23.2%和40.8%；CR成株期抗性表現(xiàn)為抗病(R)、中抗(MR)、感病(S)和高感(HS)的種質占比分別為17.2%、32.0%、32.0%和18.1%；FHB抗性表現(xiàn)為抗病(R)、中抗(MR)、感病(S)和高感(HS)的種質占比分別為4.6%，14.5%、25.7%和55.2%。 由表3可知，Cimrmanova、濟南13、GHABAGHEB、禿芒麥共4個種質對CR的苗期抗性和成株期抗性均達到R級以上，表明這4個種質具有優(yōu)良的CR抗性。隴春8號、中麥175、魯麥5號、濰麥6號、皖麥50、Reeves、石家莊8號、西農928、山麥、SAFI-1/ZEMAMRA-1、平陽181和石家莊54共12個種質對FHB的抗性達到R級水平，表明這些種質具有優(yōu)良的FHB抗性。山前麥、隴春8號、內江31、聊麥16和淮麥22共5個種質對CR和FHB均表現(xiàn)一定的抗性，且隴春8號對CR成株期抗性和FHB抗性均達到R級，表明該種質對這兩種病害兼具優(yōu)良抗性，對其抗性基因的深入挖掘及遺傳研究將有益于小麥兼抗CR和FHB品種的創(chuàng)制及選育。

表2 莖基腐病和赤霉病不同抗性水平在小麥種質中的占比Table 2 Percentage of CR and FHB resistance level in wheat germplasms %

表3 對莖基腐病和赤霉病抗性水平為抗病(R)和中抗(MR)的小麥種質Table 3 Germplasms with resistance(R) or moderate resistance(MR) to CR and FHB

2.3 小麥莖基腐病和赤霉病關聯(lián)SNP位點分析

利用全基因組關聯(lián)分析(GWAS)對311份種質資源中的CR和FHB相關位點進行了初步分析，結果(表4)表明，有6個SNPs (AX-111698714、AX-110930956、AX110374888、AX-108758442、AX-108950785、AX-108823788)與CR-SR抗性顯著相關，分別位于1A和6B染色體上；有9個SNPs(AX-110709299、AX-109031990、AX-111174283、AX-94737605、AX-110376668、AX-110372139、AX-108788482、AX-111765606、AX-94641684)與CR-APR抗性顯著相關，分別位于1A、1B、3A、3B、6A、6B和6D染色體上；有13個SNPs (AX-109640275、AX-110416806、AX-111087746、AX-108737654、AX-109875876、AX-108780881、AX-109287222、AX-109859497、AX-109585867、AX-109850910、AX-108817303、AX-111233024、AX-109942609)與FHB抗性顯著相關，分別位于5A、7A、7B染色體上。

表4 莖基腐和赤霉病抗性關聯(lián)位點Table 4 The locis associated with resistance to CR and FHB

3 討 論

種質資源是抗病育種工作的基礎。小麥FHB的抗源鑒定和篩選工作開展較早，目前在世界范圍內進行過抗FHB鑒定的小麥材料在5萬份以上。我國小麥赤霉病研究協(xié)作組對23 434份國內小麥資源材料、9 184份國外引進材料、 1 557份小麥屬其他稀有資源材料、26份山羊草屬材料和170份小黑麥材料進行了鑒定，篩選出抗或中抗材料1 796份，其中來自我國的材料占92.2%，育成品種占抗源的70%以上，表明我國小麥材料中具有豐富的FHB抗源且具有育種應用價值[20]。對于CR抗性基因及抗源篩選方面的研究，盡管國內外有關不同小麥品種(系)對莖基腐病抗性研究已有一些報道，但未發(fā)現(xiàn)免疫或高抗的抗源[16-18]。Wallwork等[21]篩選出了4個小麥品種(Gluyas Early、2-49、Sunco、Kukri)對CR具有成株抗性，并將來源于Kukri的抗性QTL定位于小麥4B染色體上的矮化基因Rht1附近；Mitter等[22]采用高通量苗期溫室鑒定對澳大利亞1 400多份小麥種質資源進行了莖基腐病抗性評價，篩選到了3個對CR具有穩(wěn)定抗性的品種(Sunco、Kennedy和Wollaroi)。張 鵬等[23]對我國82份小麥種質進行了苗期接種鑒定，沒有發(fā)現(xiàn)高抗材料，篩選出中抗的材料13份，包括CI12633、紅蚰子、FHB143、Tiszataj和紫稈子等。楊 云等[24]對黃淮麥區(qū)小麥主推品種進行了苗期盆栽接種和田間成株期接種抗性鑒定，均未發(fā)現(xiàn)免疫和高抗品種，僅有蘭考198、許科718等10個品種表現(xiàn)為中抗；Yang等[25]對234個我國黃淮麥區(qū)的小麥品種進行了溫室苗期鑒定，僅有7個品種對CR表現(xiàn)一定的抗性；石善黨[19]對近兩年黃淮麥區(qū)的國審品種同時進行了CR和FHB鑒定，發(fā)現(xiàn)僅有LS4607和存麥633表現(xiàn)對CR苗期抗性，LS4607和中育1526表現(xiàn)對CR成株期抗性和赤霉病抗性，大多數(shù)品種對CR和FHB表現(xiàn)感病。表明了目前生產上小麥品種對CR抗性整體較差。本研究對311個種質進行了CR和FHB抗性評價，結果發(fā)現(xiàn)，Cimrmanova、濟南13、GHABAGHEB、禿芒麥對CR的苗期抗性和成株期抗性水平均達到R級以上，表明這4個種質具有優(yōu)良的CR抗性。隴春8號、中麥175、魯麥5號、濰麥6號、皖麥50、Reeves、石家莊8號、西農928、山麥、SAFI-1/ZEMAMRA-1、平陽181和石家莊54對FHB達到R級抗性水平，表明這12個種質具有優(yōu)良的FHB抗性。山前麥、隴春8號、內江31、聊麥16和淮麥22對CR和FHB均表現(xiàn)一定的抗性。

到目前為止，已在不同的抗源材料中定位了數(shù)百個與FHB相關的QTL，分布在除1D、3D、5B和5D外的小麥染色體上。明確的抗病基因有7個(Fhb1～Fhb7)，其中Fhb1位于3BS染色體上，是國內外公認的抗性穩(wěn)定且效應最大的位點，并已在育種中得到廣泛的應用，目前育成抗赤霉病品種大多攜帶Fhb1基因[20]。目前已定位與CR相關的QTL涉及小麥的13條染色體[15]。本研究利用GWAS技術鑒定出與CR相關的SNP分布在1A、1B、3A、3B、6A、6B和6D染色體上，進一步表明了小麥莖基腐病抗性為數(shù)量性狀，抗性位點涉及多條染色體。目前，本課題組正在利用前期構建的相關連鎖群體對這些位點進行驗證和精細定位，以期為抗病基因的克隆和抗病品種選育奠定基礎。

CR和FHB均為鐮孢菌引起的，從CR和FHB病株中也可分離出相同的致病菌[31-32]，且人工接種下，引起CR的多數(shù)致病菌同樣能引起FHB[8,33]，因此有學者認為控制CR和FHB抗性的基因可能是一致的。但是，兩種病害在發(fā)生時間、發(fā)生條件及流行規(guī)律等方面存在很大差異，表明控制兩種病害的基因位點可能不同。Li等[34]研究證明，控制CR和FHB的QTL在不同的染色體上，也就是說CR和FHB是由不同的基因控制的。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，CR和FHB抗源種質不一致，例如，對CR苗期表現(xiàn)抗病(R)和成株期表現(xiàn)高抗(HR)的種質Cimrmanova，對FHB表現(xiàn)高感(HS)；而西農928對FHB表現(xiàn)抗性(R)，而對CR苗期和成株期均表現(xiàn)高感(HS)。本研究還發(fā)現(xiàn)，與CR和FHB關聯(lián)SNP并不在同一染色體上，說明控制CR和FHB的基因位點是不同的，已有的FHB抗性基因及種質并不能作為CR抗源。此外，有4份種質對兩種病害均表現(xiàn)出一定的抗性，說明控制CR和FHB的基因也可能存在于同一種質中，篩選這樣的兼抗種質，可為小麥兼抗CR和FHB基因的定位和育種應用奠定材料基礎。