巨型艾美耳球蟲AMA1蛋白單克隆抗體的制備及其功能鑒定

羅伏兵 ， 劉曉冬 ， 梁 琳 ， 劉賢勇 ， 徐發榮 ， 沈光年 ， 馬志軍 ， 索 勛 ， 湯新明

(1.北京市動物疫病預防控制中心 ， 北京 大興 102629 ； 2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 ， 北京 海淀 100193 ； 3.中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193)

雞球蟲病是艾美耳球蟲感染引起的嚴重危害養雞業的寄生蟲病，全球每年因球蟲病造成的損失高達30億美元[1]。以活卵囊為組分的球蟲病疫苗已有數十年的應用歷史，但存在影響雞群生產性能的風險。開發安全高效的基因工程球蟲病疫苗是學界研究的熱點。頂膜抗原(Apical membrane antigen,AMA)是頂復門寄生蟲微線體分泌的I型跨膜蛋白，由胞質區、跨膜區和胞外區組成。AMA1蛋白在頂復門原蟲中高度保守，且在子孢子階段表達水平高[2]，可能參與蟲體入侵宿主細胞。巨型艾美耳球蟲AMA1(EmAMA1)被認為是免疫原性較好的保護性抗原，具備開發成為亞單位疫苗的潛能[3]。因此，深入解析EmAMA1的生物學和免疫學功能具有重要意義。單克隆抗體具有高特異性、均一性以及方便生產的特點，是病原學或血清學檢測技術、感染與免疫機制等研究的主要工具之一。本試驗旨在構建一/多株抗EmAMA1的單克隆抗體，為EmAMA1基因功能和應用研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 巨型艾美耳球蟲北京株(中國農業大學動物醫學院保存)；SP2/0骨髓瘤細胞；次黃嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)；HRP標記的山羊抗小鼠IgG；SBA Clonotyping System-HRP；BALB/c雌性小鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)。

1.2 動物免疫 利用PCR從pSDEP2AAMA1S[4]擴增EmAMA1序列后，連接至pEt28a載體，轉化至DE3菌株進行蛋白的誘導表達。獲得大腸桿菌重組表達的EmAMA1蛋白，純化后，按每只100 μg(加弗氏完全佐劑)頸背部皮下多點注射免疫4只BALB/c雌性小鼠；間隔2周后，以相同操作進行加強免疫，劑量為每只小鼠30 μg蛋白(加弗氏不完全佐劑)，加強免疫3次。于最后1次免疫后第10天，眼眶取血，分離血清。用間接ELISA方法檢測小鼠血清中EmAMA1的抗體效價。

1.3 抗體檢測 以純化的EmAMA1(0.1 μg/孔)包被96孔酶標板，4 ℃過夜；每孔加200 μL脫脂乳封閉液，37 ℃封閉2 h；每孔加入小鼠血清(不同稀釋度)或細胞培養上清，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶20 000倍稀釋)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；加入TMB底物溶液，100 μL/孔，避光顯色5 min左右；每孔加入2 mol/L H2SO4，100 μL /孔，終止反應。用酶標儀測定雙波長(OD450 nm，OD630 nm)，記錄保存數據。

1.4 雜交瘤細胞株的建立 依據單克隆抗體的制備步驟進行。簡言之，抗體滴度符合要求的小鼠(4號小鼠)，腹腔注射50 μg蛋白，進行加強免疫。免疫后3 d取小鼠脾臟，制備脾細胞，將脾細胞與SP2/0細胞按比例混合，按照PEG法進行細胞融合。融合完的細胞均勻倒入30個半固體培養基(含HAT)，置37 ℃、5% CO2培養箱中進行篩選培養。每個培養基分別挑93個克隆培養在鋪滿胸腺細胞的96孔板中，3 d后，按1.3所述方法篩檢分泌特異性抗體的陽性孔，得到陽性雜交瘤細胞株；用“AMA1” “His標簽”包板，做第2次篩選；將2次篩選出來的陽性細胞株進行亞類鑒定，得到IgG類型陽性雜交瘤細胞株。

1.5 單克隆抗體的純化與鑒定 選擇其中的3株陽性雜交瘤細胞按體內腹水法進行大量制備，送至北京華大蛋白質研發中心有限公司進行蛋白質純化，SDS-PAGE以及ELISA檢測抗體純度及親和常數，分裝后凍存于-80 ℃，備用。

1.6 單克隆抗體的初步應用

1.6.1 單克隆抗體與全蟲抗原的反應性檢測 用巨型艾美耳球蟲全蟲抗原進行SDS-PAGE電泳，通過半干轉印法將蛋白轉印到PVDF膜上，封閉后，取稀釋(1∶5 000)的腹水作為一抗進行Western Blot檢測，檢測抗體與蟲體AMA1蛋白的特異反應性。

1.6.2 單克隆抗體檢測EmAMA1在巨型艾美耳球蟲子孢子的表達分布 將純化的巨型艾美耳球蟲提取子孢子，取稀釋(1∶2 000)的腹水作為一抗進行間接免疫熒光試驗，分析單克隆抗體與蟲體天然抗原的結合特性與檢測EmAMA1在子孢子階段的表達與分布。

2 結果

2.1 獲得分泌抗EmAMA1抗體的雜交瘤細胞株 小鼠經重組EmAMA1蛋白免疫后，產生了針對EmAMA1的特異性抗體(見中插彩版圖1)，選取4號小鼠再次進行加強免疫。取免疫后小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合后，經第1次陽性篩選，獲得47株陽性雜交瘤細胞株；經第2次陽性篩選，得到19株陽性雜交瘤細胞株。將篩選出來的19株陽性細胞株進行亞類鑒定，得到16株IgG類型陽性雜交瘤細胞株。

2.2 單克隆抗體與巨型艾美耳球蟲可溶性抗原特異性反應 巨型艾美耳球蟲蟲體抗原經SDS-PAGE分離后，以獲得的16株單克隆抗體進行免疫印跡試驗。結果顯示，編號為21與34的單克隆抗體與全蟲抗原反應后，出現清晰的目的條帶(約60 kDa)，說明這2株單克隆抗體均能夠識別巨型艾美耳球蟲中特異性的EmAMA1組分(圖2)。

圖2 利用免疫印跡試驗篩選與巨型艾美耳球蟲可溶性蛋白反應的抗EmAMA1單克隆抗體Fig.2 Selection of monoclonal antibodies against EmAMA1 that reacted with native E. maxima soluble antigens by Western Blot

2.3 EmAMA1在巨型艾美耳球蟲子孢子的表達分布 為了驗證獲得的單克隆抗體能否識別巨型艾美耳球蟲EmAMA1抗原，進行了間接免疫熒光試驗。結果顯示，篩選獲得的16株單克隆抗體，只有編號為34和45的單克隆抗體能夠識別巨型艾美耳球蟲子孢子的AMA1，在頂質體和胞漿中檢測到特異性的熒光信號(見中插彩版圖3)。結果表明，編號為34和45的單克隆抗體與EmAMA1具有良好反應性，為研究EmAMA1蛋白的表達分布及免疫學特性提供了科學依據。

3 討論

本文篩選獲得了16株抗巨型艾美耳球蟲AMA1蛋白的單克隆抗體，其中2株(編號為21和34)能夠與巨型艾美耳球蟲可溶性抗原發生特異性反應；2株(編號為34和45)能夠用于檢測EmAMA1在子孢子階段的表達與分布。初步證實編號為34的單克隆抗體可用于后續EmAMA1基因功能和免疫學的研究。

頂復門原蟲種類繁多，包括瘧原蟲、弓形蟲、巴貝斯蟲、艾美耳球蟲等。與瘧原蟲和弓形蟲相比，艾美耳球蟲基因功能的研究相對滯后，其原因在于一是艾美耳球蟲尚不能進行有效的體外培養，導致反向遺傳操作等技術平臺效率極低[5]；二是針對艾美耳球蟲研究的一些工具或試劑，比如單克隆抗體等相對缺乏。已報道的研究中，艾美耳球蟲單克隆抗體主要集中于柔嫩艾美耳球蟲的微線體蛋白，其他細胞器或蟲種的單克隆抗體極少[5-7]。巨型艾美耳球蟲是7種雞球蟲中免疫原性強的蟲種，經口免疫5個孢子化的卵囊即可產生免疫力[2]。研究表明，巨型艾美耳球蟲AMA1蛋白為其保護性抗原之一，基于EmAMA1的DNA或重組蛋白亞單位疫苗能夠為雞群提供部分抵抗巨型艾美耳球蟲感染的免疫保護力[3,5]。以柔嫩艾美耳球蟲為疫苗載體表達EmAMA1的重組球蟲同樣能夠提供一定的免疫保護力[4]。但巨型艾美耳球蟲激發宿主產生的免疫應答及保護性免疫的分子機理仍不清楚。本文制備了針對EmAMA1的單克隆抗體，為研究巨型艾美耳球蟲激發宿主產生免疫應答的機理提供了科學依據。

4 結論

本文篩選獲得了1株抗巨型艾美耳球蟲AMA1蛋白的單克隆抗體，可用于后續EmAMA1基因功能和免疫學的研究。